一株中华鳖源维氏气单胞菌的分离鉴定及抗性研究

刘晓丽　王恬畅　蒋红艳　殷蕊　宫春光

摘要：自保定阜平患病中华鳖（Pelodiscus sinensis）体内分离获得一株革兰氏阴性菌，对其形态特征、生理生化特性及１６Ｓ ｒＤＮＡ序列进行分析，鉴定其为维氏气单胞菌（Aeromonas veroni）；对分离菌株进行了29种抗菌药的药敏试验和15株益生菌的拮抗实验，得出此分离菌株对阿米卡星、头孢呋辛钠、左氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松、头孢哌酮、環丙沙星和头孢他啶等8种药物高度敏感，对青霉素、苯唑西林、庆大霉素、万古霉素、氨苄西林等其它17种药物表现为不同程度的耐药性；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

关键词：中华鳖（Pelodiscus sinensis）；维氏气单胞菌（Aeromonas veroni）；分离鉴定；药敏试验；拮抗试验

中华鳖（Pelodiscus sinensis）又名水鱼、甲鱼、团鱼，因其味道鲜美，蛋白质含量丰富，而且又有很高的药用价值，是自古以来受到人们青睐的滋补佳品。中华鳖自上世纪七十年代末开始进行人工养殖，是一种经济价值很高的淡水养殖品种。随着居民消费升级，中华鳖的需求逐年增加，集约化养殖规模也在不断扩大，随之而来的病害问题也越发严重，其中细菌性疾病尤为严重。维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）隶属于气单胞菌属（Aeromonas），是一种能引起人-畜-水生动物共患病的病原菌[1-3]。本研究对一例患病的中华鳖进行了病原菌的分离鉴定，并对分离菌株进行了29种抗菌药的药敏试验和15株益生菌的拮抗试验，旨在为中华鳖细菌性疾病的研究和防控提供参考。

1材料与方法

1.1病鳖

患病中华鳖来自保定市阜平县某甲鱼养殖场，体重340～500 g。主要症状：腹部出现大小不一的红色斑块，颈部溃烂，背甲前部有小溃疡口；解剖发现有异味。肝肿胀发黑、质碎，胃、肠壁出血，内充黏稠液体（见图1，封二）。

1.2病原菌的分离鉴定

1.2.1病原菌的分离及纯化取患病的中华鳖进行解剖，分别挑取鳖体表病灶、脾脏等部位划线接种于LB培养基，28 ℃下培养18～24 h；挑选形态特征一致的优势菌落， 28 ℃培养24 h，反复操作3次以上直至获得形态和颜色一致的菌落，纯化后的菌株以甘油（终浓度为 50%）为保护剂，置-80 ℃保存备用。将获得的单一形态的菌株命名为 AV0412。

1.2.2分离菌的鉴定

1.2.2.1生理生化分析鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[4]对病原菌进行生理生化指标分析和鉴定。无菌操作将分离菌株AV0412接种LB培养基，28 ℃培养至长出单菌落。挑取新鲜单菌落分别接种于16种细菌微量生化鉴定管中，28 ℃培养24 h或48 h，后根据测定结果分析该菌株的生理生化特性。

1.2.2.2分子生物学鉴定对菌株AV0412进行基因组DNA 提取，然后采用通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1 492Ｒ：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）进行PCR扩增， 扩增长度约 1 470 bp，获得16S rDNA 序列产物。将扩增产物送至上海迈浦生物科技有限公司进行16S rDNA测序。利用DNA Sequencing analysis软件进行分析比对，使用MEGA11的Neighbor Joining方法构建系统进化树。

1.3药敏试验

利用K-B纸片琼脂扩散法进行药敏试验， 28 ℃培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径， 测定3次取平均值。检测的抗菌药包含林可霉素、阿米卡星、青霉素、苯唑西林、庆大霉素、万古霉素、氨苄西林、卡那霉素、复方新诺明、链霉素、哌拉西林、环丙沙星、氟苯尼考、头孢他啶、阿奇霉素等29种。

1.4益生菌拮抗试验

采用LB双层平板打孔法。下层平板不加菌，上层平板加0.1 mL浓度为10⁸CFU/mL的菌液（灭菌后降温至45 ℃左右时）。待平板凝固后使用经灭菌的打孔器在平板上均匀的打6个孔（只穿过上层培养基），将孔中的培养基用灭菌牙签挑出。之后在每个孔内加20 μL益生菌液，每组三个平行，一个空白对照。将培养基置于28 ℃培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，判断益生菌对病原菌的拮抗作用。

2结果与分析

2.1细菌形态学观察

AV0412为杆菌，革兰氏阴性，不生成芽孢。在LB培养基上菌落呈圆形、表面光滑不透明、微隆起、呈现淡黄色。

2.2生理生化特性分析

分离菌株AV0412对精氨酸脱羧酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、苯丙氨酸、七叶苷和氧化酶等呈阳性; 而对赖氨酸脱羧酶、乳糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、赖氨酸和硫化氢等呈阴性反应（见表1）。参考《常见细菌系统鉴定手册》，发现分离菌株AV0412与维氏气单胞菌的生理生化特性基本一致。

2.3分子生物学鉴定

分离菌株AV0412目的条带测序后与GenBank中已公布的序列进行BLAST比对分析，发现与其他维氏气单胞菌的核苷酸相似性达到99%以上。构建的系统发育树如图2（封二）。结果显示AV0412与维氏气单胞菌（A. veronii）聚为同一分支。

综合菌株AV0412的生态特征、生理生化特性及16S rDNA序列及系统发育树分析结果， 确定菌株AV0412属于维氏气单胞菌（A. veronii）。

2.4药敏试验

药敏试验结果显示：菌株AV0412对29种抗生素中的阿米卡星、头孢呋辛钠、左氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松、头孢哌酮、环丙沙星和头孢他啶等8种药物高度敏感；对卡那霉素、哌拉西林、米诺环素和氟苯尼考4种药物中度敏感；对青霉素、苯唑西林、庆大霉素、万古霉素、氨苄西林等其它17种药物表现为不同程度的耐药性。具体试验结果见表2。

2.5益生菌拮抗试验

益生菌拮抗试验结果显示：14种益生菌中解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在高浓度时，即107 CFU/mL和108 CFU/mL浓度时对菌株AV0412有一定拮抗作用；而当浓度在106 CFU/mL以下时，则没有拮抗作用；地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等其他12种益生菌则在所有浓度时对菌株AV0412都没有抑菌效果。具体试验结果见表3。

3讨论

不同地域、不同时间段、不同养殖环境中分离出的维氏气单胞菌， 其对抗菌药的耐药性会存在一定差异。如雷宁等[5]从浙江省湖州市大口黑鲈体内分离到的维氏气单胞菌，药敏试验结果表明对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、四环素、左氧氟沙星敏感，而本研究发现，除头孢曲松和左氧氟沙星外，其他5种抗菌药均呈现中度敏感或耐药，尤其是四环素和强力霉素，表现出强耐药性；而雷宁等的试验表明对阿米卡星、诺氟沙星耐药，而本研究却表明这两种药物敏感。再如邓龙君[6]从四川某养殖场大口黑鲈体内分离得到维氏气单胞菌， 药敏试验结果表明菌株对氟苯尼考敏感，对复方新诺明、四环素、卡那霉素和多西环素存在不同耐药性，而本研究发现，分离得到的菌株对氟苯尼考和卡那霉素中度敏感，而对复方新诺明、四环素和多西环素也表现出耐药。本药敏试验的结果与其他人的研究对比，发现有部分药物的敏感性相同，有部分药物的敏感性有一定差异，而有部分药物的敏感性完全相反。以上结果说明了同一菌种的不同菌株间存在药物敏感性差异，造成菌株间耐药性差异的原因，可能与不同养殖品种、不同养殖地区在不同时间段使用抗菌药的类型、剂量等有关，胡大胜[7]、邓玉婷等[8]研究证明了病原菌耐药性与苗种来源、养殖模式、菌株来源、分离年份及各地用药习惯有关。

益生菌在水产养殖中经常直接应用到养殖水体中，除用来改良水环境如降解有机物、去除氨氮和硫化氢等有害物质外，理论上还可以拮抗条件致病菌，尤其是在消毒后使用。本研究的结果显示，只有解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对维氏气单胞菌有一定拮抗作用，且需要在107 CFU/mL以上浓度时才有作用。当然，本试验条件较为单一，试验结果仅具有一定参考意义，而在实际生产中，养殖水环境的微生态系统极为复杂，各种微生物及其次生代谢产物往往快速演变，单一条件下的试验结果不能为实际生产提供准确支撑。利用益生菌拮抗条件致病菌来防控病害是一条减少抗生素使用、具有广阔前景的路径，如何能够更有效的实现这一路径还需要进一步研究。

参考文献：

[1] GHENGHESH K S， AHMED S F， EL-KHALEK R A， et al. Aeromonas-associated infections in developing countries[J]. Journal of Infection in Developing Countries， 2008， 2（2）： 81-98.

[2] SILVER A C， WILLIAMS D， FAUCHER J， et al. Complex evolutionary history of the Aeromonas veronii group revealed by host interaction and DNA sequence data[J]. PLoS One， 2011， 6（2）： e16751.

[3] 康元環，张冬星，杨滨僮，等.维氏气单胞菌最新研究进展[J].中国人兽共患病学报， 2018， 34（5）： 452-459， 465.

[4] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 2001： 106-120.

[5] 雷宁，郝贵杰，黄爱霞，等.大口黑鲈（Micropterus salmoides）致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及其特性分析[J].海洋与湖沼，2022，53（5）：1180-1188.

[6] 邓龙君.大口黑鲈维氏气单胞菌的分离鉴定及其感染的病理损伤[J]. 河南农业科学， 2021，50（1）： 164-171.

[7] 胡大胜. 广西水产养殖主要细菌病的监测与耐药性调查[J]. 中国科技成果， 2010 （13）： 49-51.

[8] 邓玉婷， 谭爱萍， 张瑞泉， 等. 广东主要水产养殖地区气单胞菌耐药状况的调查分析[J]. 南方农业学报，2019， 50（11）： 2375-2383.

Isolation， identification， and antibiotic resistance research of

a strain of Aeromonas veronii from Pelodiscus sinensis

LIU Xiaoli WANG Tianchang JIANG Hongyan YIN Rui GONG Chunguang

（1.Ocean College of Hebei Agricultural University，Qinhuangdao 066003，China;

2.Hebei Fisheries Technology Extension Center，Shijiazhuang 050035，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences，Qinhuangdao 066201，China）

Abstract：A Gram-negative bacterium was isolated from the diseased Pelodiscus sinensis in Fuping， Baoding. Its morphological characteristics， physiological and biochemical properties， as well as the 16S rDNA sequence， were analyzed， confirming it as Aeromonas veroni. The isolated strain was subjected to susceptibility testing against 29 antibiotics and antagonistic experiments with 15 probiotic strains. It was found that the isolated strain exhibited highly sensitivity to amikacin，cefuroxime sodium，levofloxacin， norfloxacin， ceftriaxone， cefoperazone， ciprofloxacin and ceftazidime，showed resistance to 17 antibiotics in different level including penicillin， oxacillin， gentamycin， vancomycin and ampicillin，and the stain was antagonized by two probiotic strains Bacillus amyloliquefaciens and B. subtilis at certain concentrations.

Key words：Pelodiscus sinensis; Aeromonas veronii; isolation and identification; antibiotic susceptibility testing; antagonistic assay

（收稿日期：2023-07-10）