基于网络药理学和分子对接的通络化浊丸 治疗高脂血症作用机制研究

彭丽琪,姚昆鹏,蔡虎志,张小琴,朱智显,刘越美,陈青扬,陈新宇

(湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007)

高脂血症(Hyperlipidemia,HPL)是血浆中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白(LDL)含量过高或高密度脂蛋白(HDL)含量过低的代谢性疾病[1]。随着人类生活质量不断提高以及饮食结构的改变,HPL患病率逐年上升,并呈现出患病群体年轻化的趋势。据统计,我国成年HPL患者人数约占1/3,城市患病率明显高于农村[2]。常用他汀类药物具有修复血管、抗炎、营养神经等作用,但也存在风险,如升高转氨酶、溶解横纹肌、诱发白内障、加剧胰岛素抵抗等[3-4]。长期HPL易诱发冠心病、脑卒中等主要心脑血管事件,严重影响人类健康。因此,加强对HPL的预防和治疗,寻找长期使用、副作用小、能有效控制血脂的药物,便成为当务之急。中医药具有多维度、多靶点、多环节的作用特征,疗效较之于他汀类药物更加安全、可靠。深入探索低毒、高效、价廉的治疗HPL的疗法是目前亟待解决的临床问题。

通络化浊丸(原名降脂通络方)是陈新宇教授总结长期临床经验所研制的湖南中医药大学第一附属医院院内制剂,由丹参、西洋参、茯苓、三七、薏苡仁、山楂、川芎、决明子组成,具有降脂化浊、活血通络、行气散瘀之效。在前期的基础研究[5]中,发现通络化浊丸能够上调TC转运过程的关键蛋白ABCA1、apoA-1和 LCAT的表达,从而调控成熟HDL-C的形成。但是,由于通络化浊丸成分复杂,对其有效的药物组成和作用机制尚未形成科学的认识,制约在临床上的应用和推广。网络药理学具备良好的综合性和系统性,为复杂中药防治疾病、降低中药毒性、药物再利用等方面的研究开辟新的途径[6]。本研究采用网络药理学、分子对接技术,对通络化浊丸防治HPL的有效成分和主要靶标进行初步探索,以期能为HPL的防治、新药研发及阐述中药作用机制的科学内涵等提供参考。

1 材料与方法

1.1 通络化浊丸活性成分及靶点的检索

通过TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库检索中药活性成分及其靶点(筛选标准为“OB≥30%,DL≥0.18”)。利用UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库将靶点命名转换为基因符号,创建“药物-活性成分-靶点”数据集。

1.2 HPL疾病靶点的筛选

通过TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)数据库筛选HPL疾病靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络的绘制

将中药靶点与疾病靶点取交集,绘制韦恩图。导入筛选好的药物、成分以及靶标蛋白,借助Cytoscape_v3.8.2软件构建“药物-活性成分-靶点”网络拓扑图。

1.4 PPI网络的构建

将交集靶点导入STRING(https://cn.string-db.org/)数据库,构建PPI蛋白互作网络。运用Cytoscape软件中的CytoNCA插件计算节点BC、CC、DC、EC、LAC、NC数值。每次筛选均选择每项数值大于中位值的节点,最终确定PPI网络中的核心靶点。利用MCODE插件分析PPI网络的核心模块,将核心靶标蛋白的关系进行可视化处理。

1.5 GO富集和KEGG通路分析

利用R语言编辑脚本文件,对交集靶点进行生物功能富集分析。选取GO功能中分子功能(MF)、生物过程(BP)、细胞组成(CC)排名前10的结果和KEGG通路富集中排名前30的结果,并以气泡图的形式直观地展示。

1.6 分子对接

从“药物-活性成分-靶点”网络中筛选出Degree值排名前10的靶点。依据小分子配体与靶点之间的对应关系将二者配对,进行计算机模拟对接以验证网络药理学预测的结果。利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查找配体2D结构,再借助ChemBio3D软件转化为“最小自由能”优化后的3D结构。通过PDB(https://www.pdbus.org/)数据库搜索靶点的3D结构。利用PyMOL和AutoDock软件将靶点和小分子配体转化为“pdbqt”格式后进行模拟计算,运用PyMOL软件确定分子间氢键、对接位点及氢键长度,选择结合能低的对接构象进行可视化。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)平台绘制分子对接结合能热图。

2 结果

2.1 通络化浊丸活性成分和靶点

根据设定的筛选条件,共检索出100种有效活性成分。通过UniProt数据库对8味中药药物靶点进行了规范化的筛选,最终获得244个靶标蛋白,见表1。

表1 通络化浊丸治疗HPL的活性成分及作用靶点

2.2 通络化浊丸治疗HPL的作用靶点

依据5个疾病数据库的检索结果,汇总去重后得到508个HPL疾病靶点。利用在线工具Venny 2.1.0将药物靶点和HPL疾病靶点进行韦恩分析。两者取交集后得到68个共同靶点,即为通络化浊丸治疗HPL的关键作用靶点。

2.3 “药物-活性成分-靶点”网络

将中药、活性成分和交集靶点按照节点属性进行分类,并将其导入Cytoscape_v3.8.2软件,建立“药物-活性成分-靶点”网络。经计算,网络图中共有158个节点和433条边,其中,节点大小与其Degree值成正比,节点间的连线代表相互作用关系。淡紫色节点代表通络化浊丸中包含的6种有效活性成分,浅绿色节点代表通络化浊丸治疗HPL的68个潜在作用靶点,粉色节点代表复方中的8味中草药,见图1。

图1 “药物-活性成分-靶点”网络

2.4 PPI网络分析

设定筛选条件为“Minimum Required Interaction Score>0.40”,绘制交集靶点的PPI网络。经计算,PPI网络有68个节点和712条边,平均节点度为20.9,平均局部集聚系数为0.654,见图2。经两轮拓扑分析后得到PPI网络中的10个核心靶点,即VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、EGF、ICAM1、IL6、SERPINE1、TNF。第一轮筛选得到23个核心靶点。第二轮筛选得到10个核心靶点,核心靶点关系见图3。运用STRING数据库对核心靶点进行可视化处理。靶点的颜色、大小与其度值数值的大小成正相关。靶点的颜色越深,度值越大,说明发挥的作用越大。

图3 核心靶点关系

2.5 GO和KEGG富集分析

根据-LogP值和Count值进行排序,分别取GO功能和KEGG富集结果前30个条目绘制气泡图。生物功能富集分析结果见图4、图5。图中用GeneRatio表示该GO功能或KEGG通路富集的基因数量,用气泡颜色代表其显著性高低。在“P<0.05”的筛选条件下,GO功能富集分析得到1 799个条目(其中BP条目1 666个,CC条目30个,MF条目103个),KEGG通路富集分析得到105个条目。

图4 GO功能分析

由图可知,BP涉及脂多糖的反应、细菌来源分子的反应、类固醇激素反应、活性氧代谢过程、营养水平反应等。CC与膜筏、膜微结构域、质膜筏、小窝、神经元细胞膜等密切相关。MF包括核受体的活动、配体激活的转录因子活性、受体配体活动、信号受体激活物活性、类固醇激素受体活性等。关键靶点富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体活化、TNF信号通路等。脂质与动脉粥样硬化(NO.hsa05417)信号通路上存在较多的富集靶点基因,这可能是通络化浊丸治疗HPL的重要作用机制。图6中白色代表信号通路中的正常基因,红色代表通络化浊丸在HPL防治中的功能基因。

图6 功能基因在信号通路上的分布

2.6 分子对接

选取VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、EGF、ICAM1、IL6、SERPINE1、TNF作为模拟对接靶点。结合“药物-活性成分-靶点”网络的从属关系,获得6个对应的配体:芦荟大黄素、槲皮素、人参皂苷Rh2、丹参酮、山柰酚和隐丹参酮。将筛选出的前10个潜在靶点和6个小分子配体通过PyMOL和AutoDock软件进行对接验证。结合能的高低与对接构象的稳定性成反比,能量越低,表明小分子配体和靶点蛋白的结合效果越好[7]。结果显示,小分子配体与核心靶点最低结合能均<-5.0kcal·mol-1,可认为结合活性较强,筛选结果可靠。6种关键活性成分与10个核心靶点的结合活性均优于内源性配体,说明关键活性成分对核心靶点有良好的选择性和稳定性。靶标蛋白与关键活性成分、内源性配体的结合能见表2、图7,分子对接结果见图8。

图7 分子对接结合能热图

注:A.TNF与丹参酮;B.SERPINE1与人参皂苷Rh2;C.VEGFA与人参皂苷Rh2;D.EGFR与丹参酮;E.IL1B与丹参酮;F.MMP9与山柰酚;G.CCL2与人参皂苷Rh2;H.IL6与丹参酮。

表2 分子对接结合能 (kcal·mol-1)

图8中蓝色代表小分子配体,绿色代表靶点蛋白,黄色虚线代表分子间氢键。由图8所示,小分子配体主要通过氢键作用和靶点蛋白发生相互作用,体现出较强的结合能力。TNF与丹参酮在TYR-151、TYR-119处形成氢键。SERPINE1与人参皂苷Rh2在TYR-210、THR-267、THR-211、GLU-212处形成氢键。VEGFA与人参皂苷Rh2在GLU-64、LYS-107、ASP-63、ASN-62、CYS-61、GLY-59、SER-50、LEU-32。EGFR与丹参酮在MET-793处形成氢键。IL1B与丹参酮在SER-125处形成氢键。MMP9与山柰酚在GLU-47、ARG-51、TYR-52、THR-96、ASP-182处形成氢键。CCL2与人参皂苷Rh2在TYR-28、ARG-30、THR-10处形成氢键。IL6与丹参酮在GLN-76处形成氢键。

3 讨论

高脂血症为现代医学疾病名称,在古代典籍中尚未提及。虽然中医典籍中未曾明确提出脂质的概念,但是《黄帝内经》中有关于“膏”“脂”的论述与现代医学中提出的“血脂”类似[8]。《灵枢·五癃津液别》云:“五谷之津液和合而为膏者,内渗于骨空,补益脑髓,而下流于阴股。”膏脂源于水谷精微,随津液运行流动于周身,具有维持体温、储存能量、保护脏器等重要作用。在病理情况下,各种致病因素直接或间接影响脏腑,机体气血津液运行失调,膏脂代谢紊乱,形成痰浊、瘀血等病理产物,壅塞脉道而成本病[9]。高脂血症为本虚标实之候,以痰湿、瘀血为本,以脾、肾亏虚为标,病位在血脉,治宜健脾除湿、理气活血、祛痰化瘀。通络化浊丸由8味中药组成,方中丹参、三七、川芎活血化瘀,共为君药;山楂、决明子为臣药,协同发挥消食导滞、降脂化浊之效;配合佐药茯苓、薏苡仁健脾渗湿,使药西洋参补气养阴、清热生津。数药合用,故能复其气机以升清,降其凝脂以化浊,通其经络以生新。

经临床与科学研究证实,通络化浊丸具有降低血脂含量、减轻脂肪肝、减少心脑血管不良事件发生的作用,其组成合理,配伍严谨,疗效确切。丹参、山楂提取液可显著降低血清胆固醇、甘油三酯、LDL-C含量,进而降低HPL患者肝脏质量[10]。有关研究[11]指出,复方三七护脉汤具有良好的降压、降脂功效,在治疗高血压伴血管性动脉硬化方面疗效显著。山楂、决明子提取液具有抑制HMGCR基因表达、降低血脂、减轻肝组织脂肪变性的作用[12]。此外,茯苓被证实能够作用于HPL内源性产物生成和代谢途径,有效调节脂质代谢紊乱[13]。气血并治方(含川芎)能显著降低TC、LDL-C、TG含量,在脂质代谢、血小板聚集、活化分子表达等方面发挥出重要作用[14]。降脂方主要由薏苡仁、山楂、丹参、决明子等组成,具有健脾补肾、清热祛湿的功效[15]。相关研究表明,西洋参提取液能减少胆固醇的合成,并能有效控制动脉粥样硬化[16]。

本研究采用网络药理学方法对通络化浊丸防治HPL的有效组分进行初步筛选,得到6种活性成分:槲皮素,芦荟大黄素,人参皂苷Rh2,丹参酮,山柰酚,隐丹参酮。槲皮素能降低成脂基因的表达水平,可抑制肠内胆固醇的吸收,减少氧化应激[17]。芦荟大黄素能选择性地抑制前蛋白转化酶-枯草素9/LDL受体途径,从而降低胆固醇含量[18]。有关研究显示,人参皂苷Rh2可降低血浆IL-6含量,并可抑制TIMP-1、VEGFA的表达,从而发挥防治动脉粥样硬化的作用[19]。丹参酮IIA具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎等作用,能有效减少肝脏脂质沉积[20]。山柰酚能抑制PKB和提高过氧化物酶体增殖剂活化受体,从而起到降TG的作用[21]。隐丹参酮可通过激活腺苷酸激活蛋白激酶AMPK来改善胰岛素敏感性,进而调控体内脂类代谢异常[22]。综上,通络化浊丸可能通过这些活性成分表现出防治HPL的作用,包括抑制脂质吸收、抗氧化应激反应、抗动脉硬化、抗炎等,体现出通络化浊丸所含活性成分治疗HPL的有效性和多样性。

蛋白互作网络拓扑分析结果显示,通络化浊丸与HPL关联密切的核心靶点有VEGFA、IL1B、MMP9、EGFR、CCL2、ICAM1、EGF、SERPINE1、TNF、IL6。VEGFA通过调节LDL-C、HDL-C,导致炎症细胞浸润,并诱导新生血管生成,从而加速动脉粥样硬化的损害[23]。IL6通过影响TC、LDL-C、HDL-C的含量,增加血液黏滞度,在炎症反应、动脉粥样硬化、血栓形成中起着关键作用[24]。研究表明,IL1B在高胆固醇血症的脂肪变性及肝纤维化中扮演重要角色[25]。MMP9是HPL患者早期动脉粥样硬化的一个重要血清学指标,MMP9的表达水平与颈动脉中膜厚度有显著的相关性[26]。EGFR抑制剂可明显降低血清LDL、TCH、TG的含量,并能明显减轻肥胖引起的心肌损伤[27]。有关研究显示,CCL2在不同类型肝损伤中表达增高,并可能参与肝组织的炎症反应,对HPL的发生和肝脂肪变性有重要影响[28]。ICAM-1基因活化后,可使单核细胞聚集并迁移至血管内皮细胞,并能增强炎症反应、免疫反应、细胞凋亡、动脉硬化及血栓形成[29]。SERPINE1是一种普遍存在于糖-脂代谢疾病中的生物标志物,参与脂肪和能量代谢。有关研究指出,TNF-α是一种非特异性免疫调节剂,可以直接或间接地影响脂肪细胞内脂类物质的合成及降解[30]。综合以上研究发现,通络化浊丸在防治HPL中具有抗氧化应激、抑制炎症反应、抗动脉粥样硬化、减少血栓形成等多重作用。

通过GO功能和KEGG富集分析,本研究发现关键靶点在HPL相关的生物功能和信号途径上表现出明显的富集。通络化浊丸治疗HPL的作用机制主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体活化、TNF信号通路、HIF-1信号通路等。AGE-RAGE信号通路在调节糖尿病血管重塑中起着重要作用,可以通过AGE受体的传递而诱导血糖、血脂和血压的增高,从而促进动脉粥样硬化[31]。大量研究显示,流体剪切应力能够通过调控基因表型,影响血管内皮的结构与功能,进而抑制动脉粥样硬化斑块的形成[32]。有关研究指出,TNF信号通路的下调可以抑制糖尿病性视网膜病变所致的血管炎症反应,并能抑制脂肪细胞miRNA的转录[33-34]。HIF-1α不仅可以通过上调VEGF的表达来促进血管新生,还能通过调节CXCL1的表达来增加脂质在局部的蓄积,从而提高脂质含量[35-36]。据此,通络化浊丸具有抗炎、保护内皮细胞的作用,并通过抑制血管新生来防止HPL的发生。

本研究在网络药理学方法的基础上,初步确定通络化浊丸治疗HPL的主要活性成分及核心靶点,并进一步证实其在HPL的治疗中具有多组分、多靶点、多途径的作用特点。通过计算机模拟分子对接,证明通络化浊丸的主要活性成分与核心靶标之间具有较强的结合活性,为进一步的动物及细胞实验研究奠定基础。