复方参及合剂对小鼠急性毒性实验研究

李 萌,马博华,许 琴,张东辉,李 倩,王晓锋,尹东锋*

(1.石河子大学 药学院,新疆 石河子 832003,2.中国人民解放军新疆军区 总医院,新疆 乌鲁木齐 830000)

复方双参合剂是课题组前期将人参皂苷和丹参提取物组合而成的制剂,实验研究证明其提高抗缺氧耐疲劳作用明显[1-2]。缺氧疲劳是世居平原地区的人群快速进入高原环境时,机体内氧化应激失衡、劳动力普遍降低的一种高原反应。因此,寻找有效提高高原环境下机体作业能力的干预措施具有重要意义[3]。本实验在复方双参合剂的基础上添加肉苁蓉和欧白及两味中药,组合成复方参及合剂,以期达到效果更优的抗缺氧耐疲劳作用。

复方参及合剂以人参、丹参为君药,人参具有大补元气、补脾益肺的功效,能提高抗衰老能力[4],增强免疫调节作用[5]。研究发现,人参皂苷是人参适应性合成的主要次生代谢产物,具有化学抵御能力、抵抗环境胁迫的作用[6]。丹参为中医临床常用药,能够加快血液循环,提升心肌活力,对肝脏具有保护作用[7],其提取物具有抗癌、抗氧化、增强免疫、修复受损神经等药理作用[8]。复方参及合剂以肉苁蓉为臣药,肉苁蓉作为补益中药,具有极高的药用价值,素有“沙漠人参”之美誉,可补肾阳、益精血、保护神经及脏器组织[9],肉苁蓉苯乙醇苷为肉苁蓉的主要药效成分,具有抗缺血[10]、抗缺氧、抗疲劳作用[11];以欧白及为佐药,《中华本草-维吾尔药卷》中记载,欧白及具有温肾补阳、填精肥体、滋补支配器官(心、肝、脑等)、强筋健肌、补血生精之功效。对复方参及合剂进行急性毒性实验研究,可为进一步研究提供实验数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACS-1.5A型电子计重秤(上海友声衡器有限公司);TDZ5电动离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);BC-2800Vet全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);BS-180全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);YB-6D生物组织石蜡包埋机(湖北孝感亚光电子技术公司);LEICA RM2135回旋式切片机(德国徕卡股份有限公司);CX43光学显微镜(日本Olympus工业有限公司)。

1.2 试药

人参皂苷提取物(含80%,批号20210420)、肉苁蓉苯乙醇苷提取物(含80%,批号:20210420)均由西安赛奥生物技术有限公司提供;丹参提取物(10∶1,批号:R18J11Y116119),由上海源叶生物科技有限公司提供;欧白及(原料药)由新疆维吾尔制药有限责任公司提供。V-28D兽用血液细胞分析仪用稀释液(批号:2021112701)、谷丙转氨酶(Alanine amino transferase,ALT,批号:140121004)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST,批号:140221003)、肌酐(Creatinine,Cr,批号:141121009)、尿素(Urea,Ur,批号:141321005)、葡萄糖(Glucose,Glu,批号:141521005)、尿酸(Uric acid,UA,批号:141221004)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK,批号:142522002)、甘油三酯(Triglyceride,TG,批号:141721004)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH,批号:142721003)均由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供。

复方参及合剂制备:将欧白及原料粉碎后过筛,加10倍量蒸馏水,在65℃下搅拌4h,使其完全溶解至胶状,得到欧白及溶液;欧白及溶液中加入按照质量份称取的丹参提取物,旋桨式搅拌器下600r/min搅拌2h,至药物混合并完全溶解;在上述溶液中加入按照质量份称取的肉苁蓉苯乙醇苷提取物,旋桨式搅拌器下700r/min搅拌1.5h,至完全溶解;最后在上述溶液中加入人参皂苷提取物,旋桨式搅拌器下800r/min搅拌1.5h,至四种提取物均完全溶解,根据不同量的配比制成低、中、高不同浓度的复方参及合剂。

1.3 实验动物

SPF级昆明小鼠,雌雄各半,体质量(20±2)g。购自新疆医科大学实验动物中心,动物许可证号:SCXK(新)2018-0002。适应性饲养1周,温度18～25℃,相对湿度50%～70%,光照条件为12h明暗交替。动物实验符合伦理学标准,并得到伦理委员会批准。

2 方法

2.1 半数致死量(LD50)实验

SPF级昆明小鼠24只,雌雄各半,按体质量随机分成8组,每组3只,分别为正常对照雌、雄组、低剂量雌、雄组(1.0g/kg)、中剂量雌、雄组(2.0g/kg)、高剂量雌、雄组(3.0g/kg),各组小鼠给药前禁食不禁水12h,按20mL/kg体质量灌胃,2次/d,连续7d,并记录每日体质量。观察小鼠活动变化,精神状态、进食情况、体质量变化及死亡数,于末次给药1h后处死并立即解剖,观察小鼠心、肝、脑、肺等脏器变化。

2.2 最大给药量(MLD)实验

SPF级昆明小鼠24只,分组及给药方式同上“2.1”项,按20mL/kg体质量灌胃,3次/d,连续观察7d,并记录每日体质量,小鼠处理同“2.1”项。

2.3 急性毒性实验

SPF级昆明小鼠112只,雌雄各半,分为8组,每组14只,分别为正常对照雌、雄组、低剂量雌、雄组(1.0g/kg)、中剂量雌、雄组(2.0g/kg)、高剂量雌、雄组(3.0g/kg),实验前禁食不禁水12h,按20mL/kg体质量灌胃(每1mL含6g生药量),每日1次,连续14d,记录给药前、给药第7天、给药第14天的体质量,并观察小鼠活动变化、精神状态、进食情况、体质量变化等毒性反应及死亡情况。

2.3.1 指标检测 于末次给药1h后记录小鼠体质量并采集血液,采用全自动血细胞分析仪检测血常规指标:白细胞数(White blood cell,WBC)、淋巴细胞数(Lymph,Lym)、单核细胞数(Monday,Mon)、中性粒细胞数(Granulocyte,Gran)、红细胞数(Red blood cell,RBC)、血红蛋白(Hemoglobin,Hb)、红细胞压积(Red blood cell specific volume,HCT)、血小板数(Platelet,Plt)、血小板压积(Plateletocrit,PCT);采用全自动生化分析仪检测生化指标:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素(Ur)、葡萄糖(Glu)、尿酸(UA)、肌酸激酶(CK)、甘油三酯(TG)、乳酸脱氢酶(LDH)。

2.3.2 脏器组织病理学检查 于末次给药1h后处死小鼠,取心、肝、脑、肺脏器组织,用甲醛溶液固定、组织脱水、石蜡包埋、HE染色,做病理组织学检查。

2.4 数据统计与处理

3 结果

3.1 半数致死量实验结果

小鼠分别灌胃低、中、高3个剂量组药物浓度的复方参及合剂后观察7d,各组小鼠均无异常表现,精神状态良好,饮食正常,未发现死亡,解剖后观察各脏器组织未发现异常变化,各组小鼠体质量均明显增加,证明此药无明显毒性反应,见图1。

3.2 最大给药量实验结果

小鼠分别灌胃低、中、高3个剂量组药物浓度的复方参及合剂后观察7d,各组小鼠均无异常表现,精神状态良好,饮食正常,也未发现死亡,解剖后观察各脏器组织亦未发现异常变化,各组小鼠体质量均明显增加,证明此药无明显的毒副作用,见图2。

图2 小鼠MLD体质量变化曲线

3.3 急性毒性实验结果

3.3.1 小鼠体质量变化 与给药前相比,给药7d、给药14d,各组小鼠均无异常表现,精神状态良好,饮食正常,无实验动物死亡,且随着实验时间延长,各组小鼠体质量均增加,但无显著性差异(P>0.05),见表1。

表1 复方参及合剂对各组小鼠体质量变化的影响

3.3.2 小鼠血常规检测指标变化 与正常对照组比较,给药组血常规数量包括白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、中性粒细胞数、红细胞数、血红蛋白数、红细胞压积数、血小板数、血小板压积数均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 复方参及合剂对各组小鼠全血检测指标变化的影响

3.3.3 小鼠生化检测指标变化 与空白组比较,各组小鼠ALT、AST、UA、UREA、CREA、GLU、TG、CK、LDH均无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 复方参及合剂对各组小鼠生化检测指标变化的影响

3.3.4 小鼠脏器组织病理变化 与正常组相比,复方参及合剂不同剂量组小鼠心脏、肝脏、脑、肺组织均无显著性差异,各组织器官结构正常,未发现异常病理学变化,见图3。

图3 组织病理切片(HE×100)

4 讨论

复方中药制剂多组分间相互作用,具有多方面、多层次、多靶点的治疗优势,发挥着综合生物效应[12],但其作用机理较为复杂,其安全性问题成为保护临床受试者安全、理解药物毒理学特性的重要来源[13],也是影响民族医药产业健康持续发展的重大科学问题[14-15]。ZHU等[16]实验研究表明,人参皂苷可对脑血管疾病发挥有益的药理和药效作用,可显著减轻血管舒缩功能,阻碍血小板活化,发挥抗血小板和抗血栓的作用。YU等[17]在研究丹参提取物协同效应和有效分子机制时,观察到其对心脏具有保护作用,病理学检查发现,可减轻抗癌药物引起的心肌细胞凋亡,有效减少与氧化应激反应和各种代谢途径相关的蛋白质的羟基化,保护介导的H9c2细胞的凋亡。蓝天伟[18]研究发现,肉苁蓉苯乙醇苷能增强细胞存活能力,减少H2O2诱导细胞损伤后LDH释放量,有效降低细胞凋亡率,抑制内质网应激引起的心肌细胞损伤,发挥保护细胞的作用。实验研究表明,人参皂苷[5]、丹参提取物[17]、肉苁蓉苯乙醇苷[19]均具有确切的疗效且无毒性反应。

急性毒性实验是指受试动物1次或24h内多次染毒后出现毒性反应的实验[20]。半数致死量(LD50)是评价药物急性实验的一个重要指标,能够有效评价药物的急性毒性,LD50越大,表明该药物毒性越低[21],实验中未测出复方参及合剂的LD50值,表明复方参及合剂毒性很小,不存在毒副作用。最大给药量(MLD)是指在合理的给药浓度及给药容量的前提下,1日内单次或多次(2～3次)允许给予实验动物的最大给药剂量,在一定时间内出现的毒性反应[20]。本实验通过多次灌胃给药,观察不同剂量组小鼠活动变化、精神状态、饮食情况、体质量均无异常表现,亦未出现中毒或死亡情况,小鼠各脏器组织均未见异常[22],小鼠灌胃给药复方参及合剂低、中、高剂量组最大给药量分别为3.0g/kg、6.0g/kg、9.0g/kg,相当于临床拟推荐日剂量0.3g/70kg的700倍、1 400倍、2 100倍。血液学检查和血液生化检查是评价药物对机体和组织器官病变的重要指标[23],能够衡量出药物对血液细胞及肝肾功能的损伤[24],实验结果显示,与正常对照组比较,复方参及合剂低、中、高剂量组白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、中性粒细胞数、红细胞数、红细胞压积数、血小板数、血小板压积数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素、葡萄糖、尿酸、肌酸激酶、甘油三酯、乳酸脱氢酶等均无显著性差异。组织HE染色是深入至组织细胞水平,对实验动物的健康进行直观判断的一种病理学检查[25],镜下观察显示,各脏器组织结构均正常,无明显病理性变化。

综上所述,将丹参提取物、人参皂苷提取物、肉苁蓉苯乙醇提取物、欧白及组合成复方参及合剂,以灌胃给药的方式研究其对雌雄双性小鼠的急性毒性作用,结果发现,经组合后可多途径、多靶点作用于机体,无急性毒性反应且安全性较高,可为其进一步药理学研究、作用机制研究提供理论依据。但此次实验主要针对急性毒性进行研究,可能还存在慢性毒性或亚慢性毒性,因而对于复方参及合剂的安全性评价还需进行综合考虑[26]。