厚朴花与山玉兰花鉴定研究

占丽琴,方 磊,毕 武,马 杰,王银红,罗 艳,孙 辉,丁 野*

(1.湖南省药品检验检测研究院,湖南 长沙 410001;2.湖南省药品质量评价 工程技术研究中心,湖南 长沙 410001)

厚朴花为厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.和凹叶厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥花蕾,稍蒸后,晒干或低温干燥[1]。据考证,厚朴首载于《神农本草经》,为药用植物厚朴的皮,厚朴花最早记载于1936年出版的《饮片新参》,为药用植物厚朴的花蕾[2-3]。山玉兰花为木兰科植物山玉兰MagnoliaedelavayiFranch.的干燥花及花蕾,为市场厚朴花的常见混淆品[4-6]。近年来,对厚朴花与山玉兰花的研究多针对化学成分,而性状显微的研究较少[7-8]。本研究结合传统性状显微鉴别与现代DNA条形码技术,准确、科学地对厚朴花与山玉兰花进行鉴定,为厚朴花与山玉兰花进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

DM2500 荧光显微镜(德国Leica),Leica M205C体视显微镜(德国Leica),RX100M6数码相机(日本SONY),MM400组织研磨仪(德国Retsch),DK-450B电热恒温水槽(上海森信),Labcycler型PCR扩增仪(德国senso),水合氯醛溶液(实验室自制),DNA提取试剂盒(天根公司),引物为psbAF:5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′;trnHR:5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

1.2 样品

本研究共收集8份厚朴花样品,其中4份为市场收集,另4份为自采样本;12份山玉兰花样本均为市场收集,均经湖南省药品检验检测研究院丁野主任中药师鉴定,样品标本保存于湖南省药品检验检测研究院中药所,典型样品见图1、表1。

注:A.厚朴花,B.山玉兰花。

2 方法

2.1 传统经验鉴别

2.1.1 性状鉴别 结合体视显微镜对样品进行性状观察、比较、记录。结果显示,厚朴花与山玉兰花的性状在形状、花被、心皮及花梗方面差异明显,见图2、表2。

表2 厚朴花与山玉兰花的性状特征

注:A.厚朴花特征;B.山玉兰花特征;1.花梗(Pedicel);2.花被(Perianth);3.心皮(Carpel);4.雄蕊(Stamens)。

2.1.2 显微鉴别[5,9-10]分别取厚朴花与山玉兰花完整花蕾或花数朵,研细,过筛,粉末备用。取适量粉末置载玻片,滴加水合氯醛数滴,盖盖玻片,加热透化,至显微镜下观察。结果显示,厚朴花与山玉兰花的粉末特征表皮细胞、花粉粒、石细胞、油细胞无明显差异,但山玉兰花粉末特征草酸钙簇晶、非腺毛明显,见图3、图4、表3。

注:1.花被表皮细胞(Perianth epidermal cells);2.石细胞(Stone cell);3.油细胞(Oil cell);4.花粉粒(Pollen grain)。

注:1.花被表皮细胞(Perianth epidermal cells);2.石细胞(Stone cell);3.油细胞(Oil cell);4.花粉粒(Pollen grain);5.草酸钙结晶(Calcium oxalate crystal)(5a-可见光下,5b-偏光下);6.非腺毛(Non-glandular hairs)。

2.2 DNA条形码鉴别[11]

鉴于本研究项目部分来源为市场收集,无法从原植物考证样本的准确性。为进一步鉴定样本,项目组对样本均进行DNA条形码鉴别,具体如下。

2.2.1 总DNA的提取及测序[12-13]取样品粉末50mg,裂解约3h,利用天根植物基因组提取试剂盒进行DNA提取。引物为psbA-trnH(F,R),反应总体积为25μL,DNA模板加入量为1μL,扩增,采用凝胶电泳对序列进行检验,样品(1、2、5)检验未出条带,取消测序,其他PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。结果样品(18)测序无信号,其他16份样本均测序成功。

2.2.2 BLAST结果 将经CodenCode Aligner处理后的数据在NCBI的BLAST网站上进行比对。结果显示,16份测序成功的样本中4份(4、17、19、20)样品的psbA-trnH序列与Genbank上厚朴(Magnoliaofficinalis)、凹叶厚朴(Magnoliaofficinalissubsp.biloba)高度匹配(相似度>90%);另12份样品的psbA-trnH序列与Genbank上山玉兰(Magnoliadelavayi)高度匹配(相似度≥99%),具体查询号见表4,典型图见图5、图6、图7。与传统性状显微鉴别结果一致。

表4 样品序列BLAST结果

图5 与Genbank数据库(Magnolia officinalis)比对结果

图6 与Genbank数据库(Magnolia officinalis subsp.biloba)比对结果

图7 与Genbank数据库(Magnolia delavayi)比对结果

3 讨论

3.1 性状描述

厚朴花现行标准《中华人民共和国药典》2020年版一部中描述“花梗长0.5～2cm,密被灰黄色绒毛,偶无毛”[1]。本次收集经鉴定的厚朴花样品花梗均无毛,与标准及文献的描述有差异[4-10]。查阅《中国植物志》厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.)项下描述“花梗粗短,被长柔毛”[14]。查阅历版《中华人民共和国药典》中厚朴花花梗的描述,均记载“密被灰黄色绒毛”[15-23]。为保证研究的准确性,课题组开展多次调研,调研结果显示厚朴“花梗长0.5～2cm,偶见稀疏的长柔毛”。

3.2 DNA条形码鉴别

本研究前期选择ITS2、psbA-trnH序列进行扩增、测序,但结果表明,ITS2测序峰图干扰峰较多;而psbA-trnH测序峰图质量更好。此外,厚朴花的psbA-trnH测序成功率仅50%,山玉兰花的psbA-trnH测序成功率100%。分析原因,厚朴花采摘后稍蒸,再干燥而得,经蒸制、长时间的保存可能会导致DNA降解,导致样本测序成功率较低[1,11];山玉兰花采摘后直接干燥,未经过高温蒸制,DNA保存较完整,有利于DNA的提取及后续测序[11,24-25]。

本研究用样品采收期厚朴花为花蕾,山玉兰花为花及花蕾;炮制工艺厚朴花为经蒸制再干燥,山玉兰花为直接干燥。两者在性状上表现为厚朴花花蕾完整、颜色较深,而山玉兰花常纵剖、颜色稍浅。厚朴花性状中颜色、形态、花梗与心皮是否被柔毛,是与山玉兰花区别的重要鉴别点。厚朴花的显微鉴别无非腺毛,与性状鉴别一致。此外,本研究运用DNA条形码技术从基因的层面鉴定厚朴花及山玉兰花,鉴定结果与传统性状显微鉴别结果一致,说明先进科学技术可以有效服务于中药事业创新发展[25]。