不同产地密蒙花指纹图谱研究

丁 青,王利伟,梁月仪,刘晓霞,黄小丹,陈向东,孙冬梅

(广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244)

密蒙花为马钱科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序,是中医处方和成药中的常用中药,具有清热泻火、养肝明目、退翳的功效,用于治疗目赤肿痛、多泪羞明、目生翳膜、肝虚目暗、视物昏花[1],现代药理作用有抗炎、抗菌、免疫调节、降血糖、抗氧化、治疗帕金森和对抗眼部疾病等[2]。密蒙花主要分布于我国陕西、云南、贵州等地[3]。通过查阅文献发现,密蒙花中主要成分为黄酮类和苯乙醇苷类[4],从密蒙花中分离鉴定出的黄酮类化合物有木犀草素、蒙花苷、芹菜素、秋英苷等[5],苯乙醇类化合物有毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等[6]。

由于中药的药效常常是多个活性成分的综合作用,用多指标进行中药的质量控制已得到整个行业的共识[7]。中药指纹图谱着重体现中药整体特性,但无法表征有效成分的绝对量,无法精准表述中药质量,为深入挖掘指纹图谱的内在数据与变量,采用化学模式识别特征性地识别指纹图谱尤为关键[8]。因此,本次研究将建立指纹图谱结合化学模式识别技术的密蒙花质量控制方法,并在此基础上对共有指纹峰进行成分鉴别,有利于实现中药质量的全面控制[9],为深入研究密蒙花药材质量控制方法提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

仪器:Thermo Vanquish 超高效液相色谱仪,Thermo 二极管阵列检测器(DAD),Waters ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),Waters ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1mm×150mm,1.8μm),ME204E型万分之一天平(梅特勒-托利多公司),HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司),KQ-500DE型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),Thermo 超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)。

1.2 试剂

色谱级乙腈和甲醇均购自默克股份有限公司,Milli-Q超纯水(实验室自制);分析级甲醇和乙醇购自西陇科学股份有限公司,蒙花苷(中国食品药品检定研究院,批号:111528-201710,含量:96.6%),毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院,批号:111530-201713,含量:92.5%),芹菜素(中国食品药品检定研究院,批号:111901-201603,含量:99.2%)。

1.3 材料

本次实验密蒙花药材由广东一方制药有限公司采购管理部于产地搜集,经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为马钱科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序。经检验均符合2020年版《中华人民共和国药典》密蒙花药材项下规定。样品产地信息见表1所示。

表1 密蒙花样品信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

分别精密称取蒙花苷、毛蕊花糖苷对照品适量,分加70%甲醇溶解制成质量浓度分别为16.585μg·mL-1、16.125μg·mL-1的溶液。另取芹菜素对照品适量,加70%甲醇溶解制成质量浓度为15.356μg·mL-1的溶液。

2.2 供试品溶液制备

取密蒙花药材粉末(过三号筛)约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入70%甲醇100mL,称定质量,加热回流45min,放冷,再称定质量,用70%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×150mm,1.8μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脱,0～5min,25%→30% A,5～15min,30% A,15～18min,30%→38% A,18～35min,38%→45% A,35～55min,45%→80% A。体积流量0.2mL·min-1,柱温为30℃,检测波长为326nm,进样体积为1μL。

2.4 色谱与质谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm);其余色谱条件同“2.3”项下。

采用电喷雾离子源(HESI),正、负离子分别检测,毛细管喷雾电压为3.5kV,毛细管温度为350℃。样品扫描采用Full-MS(dd-MS2),一级质谱采集范围m/z70～1 050,分辨率为17 500,碰撞能(NCE)为20V。

2.5 指纹图谱建立

取20批不同产地的密蒙花药材,按“2.2”项下制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样测定,记录20批密蒙花药材色谱图,并将所有的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版进行分析。以MMH01为参照图谱,对20批密蒙花药材指纹图谱共有峰进行匹配,选择分离度较好、峰型对称、峰纯度高、峰面积较大的色谱峰为指纹峰,共标定11个指纹峰,共有峰模式见图1。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

2.6 指纹峰指认

为了深入研究密蒙花成分,本次研究采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)对密蒙花中的化学成分进行定性分析,根据所获得的分子碎片峰、精确相对分子质量等色谱信息,快速分析鉴定密蒙花药材共有指纹峰的成分。

取“2.2”项下供试品溶液,按照“2.4”项下的色谱与质谱条件进行分析,得到密蒙花药材正、负离子模式下的总离子流图,如图2所示。根据实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差小于5ppm,同位素丰度比以及一级、二级质谱碎片信息等,结合Thermom/zVault数据库及文献信息,对11个指纹峰化合物进行推断鉴别,结果如表2所示。

图2 密蒙花药材正离子(A)和负离子模式下总离子流图(B)

表2 密蒙花指纹峰鉴别结果

2.7 方法学验证

2.7.1 专属性试验 取空白溶剂(70%甲醇)、对照品溶液、密蒙花样品MMH01供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样,结果表明空白溶剂不干扰指纹峰的检测。见图3。

注:5.毛蕊花糖苷;9.蒙花苷;10.芹菜素。

2.7.2 精密度试验 取密蒙花样品MMH01供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样,连续进样测定6次,以3号峰(毛蕊花糖苷)为参照峰,计算11个指纹峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.08%范围内,相对峰面积RSD值在0.41%～1.70%范围内,表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性试验 取密蒙花样品MMH01供试品溶液,于室温下放置,分别在制备后的0h、3h、4h、6h、13h、24h进样测定,以3号峰(毛蕊花糖苷)为参照峰,计算11个指纹峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.10%范围内,相对峰面积RSD值在1.40%～2.38%范围内,表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7.4 重复性试验 取同一批密蒙花样品粉末6份,按“2.2”项下制备6份供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样测定,以3号峰(毛蕊花糖苷)为参照峰,计算11个指纹峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.06%范围内,相对峰面积RSD值在0.59%～2.96%范围内,表明该方法重复性良好。

2.7.5 指纹图谱的建立及相似度评价 将所有的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》,采用平均数法生成对照指纹图谱,对照指纹图谱见图4,并进行相似度计算,MMH01～MMH20指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均>0.90,相似度结果见表3,表明各批次药材之间的质量比较稳定。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

表3 20批密蒙花药材相似度计算结果

2.8 指纹图谱化学模式识别分析

2.8.1 系统聚类分析 采用SPSS 20.0软件,对20批密蒙花指纹图谱共有峰峰面积进行标准化处理,采用Ward法,以平方欧氏距离为测度,全矩从-1至1标准化转化,进行聚类分析,结果见图5。当类间距离在15时,密蒙花药材被分为3类,其中MMH01～MMH03、MMH10～MMH12聚为第Ⅰ类,其中MMH01～MMH03来源于陕西省安康市,而MMH10～MMH12来源于云南省德宏市;MMH09、MMH15、MMH16～MMH20聚为第Ⅱ类,均来源于贵州省凯里市;MMH04～MMH08、MMH13～MMH14聚为第Ⅲ类,其中MMH04～MMH06、MMH14来源于陕西省安康市,MMH07～MMH08、MMH13来源于四川省绵阳市。

图5 20批密蒙花样品聚类分析树状图

将20批密蒙花指纹图谱共有峰峰面积同时采用SIMCA14.1软件绘制PCA得分图,结果见图6。由PCA得分图可知,20批密蒙花药材分成3类,与系统聚类分析结果一致。

分类结果表明贵州省凯里市、云南省德宏市、四川省绵阳市产区的密蒙花药材可以实现较好的分类,表明这3个产地的药材质量各自具有一定的相似性,而陕西省安康市的密蒙花药材有4批能与四川省绵阳市产区的样品聚为一类,另有3批能与云南省德宏市产区的样品聚为一类,表明陕西省安康市的药材质量波动较大。

2.8.2 主成分分析 采用SPSS 20.0软件,将20批密蒙花指纹图谱共有峰峰面积进行标准化处理,计算主成分特征值、累计贡献率及主成分得分。以特征值>1为标准,提取出的主成分有3个,累积方差贡献率为84.64%,表明提取出的3个主成分反映了20批密蒙花药材指纹图谱的主要信息,碎石图进一步说明了3个主成分可以表征密蒙花的整体特征,见图7。由于载荷值越高,表明变量对主成分的影响越大。根据载荷矩阵表4,可知主成分1主要与峰1、峰2、峰5、峰9有关,主成分2主要与峰3、峰6、峰11有关,主成分3主要与峰3、峰8有关,表明密蒙花的质量差异是由多个成分同时影响,因此密蒙花药材质量应采用多指标成分共同控制。

图7 20批密蒙花样品主成分分析碎石图

表4 20批密蒙花样品载荷矩阵

2.8.3 正交偏最小二乘判别分析 为了进一步明确上述3类密蒙花药材之间产生差异的主要标志物,采用OPLS-DA对20批密蒙花药材进行对比分析。由于VIP值越大,表明该化学指标对于解释变量的贡献越大,因此可以VIP>1作为标准,得出密蒙花药材之间的差异标志物。使用OPLS-DA建模分析,筛选出3个预测主成分,累积解释能力参数R2x和R2y分别为0.9、0.7,预测能力参数Q2为0.5,表明所建立的模型稳定、可靠。以VIP>1的色谱峰为差异标志物,如图8所示,峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8的VIP值分别为1.19、1.11、1.11、1.08、1.06、1.02,因此峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8可作为区分密蒙花质量差异标志物。

图8 密蒙花药材指纹图谱OPLS-DA模型的VIP得分

3 讨论与结论

3.1 指纹图谱条件确定

本研究对供试品溶液的制备进行了优化,考察了提起溶剂、提取方式对指纹图谱测定结果的影响,结果表明,当采用70%甲醇为提取溶剂,加热回流为提取方法时,11个指纹峰的响应最大。对比了0.1%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液对色谱峰分离效果的影响,结果表明,当采用0.1%甲酸溶液为水相流动相时分离效果最佳。在200～400nm范围内进行全波长扫描发现,当检测波长为326nm时,各指纹峰响应最大,色谱峰信息全面,因此本研究在326nm下测定。

3.2 化学模式识别分析

对密蒙花药材指纹图谱采用相似度分析、系统聚类分析、主成分分析方法以及正交偏最小二乘判别分析,以全面评价药材质量。通过PCA分析和聚类分析发现,采自陕西省安康市的7批样品被分成2类,有4批能与四川省绵阳市产区的样品聚为1类,另有3批能与云南省德宏市产区的样品聚为1类,表明该产区的药材质量差异较大,对这7批样品的指纹峰峰面积进行分析发现,MMH01～MMH03的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面积为4.556～6.594,MMH04～MMH06、MMH14的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面积为6.925～15.685,后4批的峰5的峰面积明显高于前3批,说明毛蕊花糖苷的含量具有一定差异,这可能是二者各自聚为1类的原因,因此在后续研究中可以增加该指标定量测定。通过OPLS-DA分析筛选出6个差异性标志物,因此在后续研究中可以重点关注峰1、峰3、峰6、峰7、峰8、峰11,可采用多指标成分测定对密蒙花药材进行质量控制。

3.3 色谱峰指认

密蒙花指纹图谱11个指纹峰,其鉴定依据主要是根据二级质谱碎片离子与文献报道[10]进行比对推导。例如,保留时间为9.52min的峰1,负离子扫描模式下准分子离子峰为m/z621.110 7,二级裂解碎片可见m/z445.078 0、m/z269.045 7,通过Xcalibur数据处理平台,以及文献报道鉴定该化合物为Clerodendrin;保留时间为10.15min的峰2,负离子扫描模式下准分子离子峰为m/z785.251 6,二级裂解碎片可见m/z623.219 5、m/z161.023 4,通过Xcalibur数据处理平台及文献报道鉴定该化合物为Echinacoside;保留时间为20.78min的峰6,负离子扫描模式下准分子离子峰为m/z447.093 8,二级裂解碎片可见m/z285.040 7、m/z327.052 8,通过Xcalibur数据处理平台及文献报道鉴定该化合物为木犀草苷。保留时间为37.16min的峰8,正离子扫描模式下准分子离子峰为m/z739.245 3,二级裂解碎片可见m/z593.187 2、m/z285.075 8,通过Xcalibur数据处理平台以及文献报道鉴定该化合物为Neobudofficide。对于尚未采用对照品再验证的化合物,还需进一步采用对照品进行确证。

3.4 结论

本实验建立了密蒙花指纹图谱检测方法,该方法稳定且专属性较好。对不同产地的密蒙花药材指纹图谱采用相似度分析及化学计量学进行分析发现,贵州省凯里市、云南省德宏市、四川省绵阳市产地的药材质量各自具有一定相似性;并且不同产地并找到6个密蒙花药材质量差异性标志物,通过UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术以及Thermom/zVault数据库及文献信息已推测出其分子式,这可为更加全面评价密蒙花药材质量提供借鉴。