PAI-1基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢深静脉血栓形成的影响

张建军，靳志雄，胡常晖，黄秀萍

（张家口市第一医院a.急诊科；b.普外一科；c.肾内科，河北张家口 075000）

下肢深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是一种常见的血管疾病，典型症状包括疼痛、肿胀、发红和水肿等[1-2]。DVT的治疗包括药物疗法和物理疗法，未经治疗的DVT可能诱发肺栓塞，甚至会危及生命[3-4]。尽管其发病率相对较高，但我们对其发病机制的了解仍不充分。DVT患者主要表现为凝血系统和纤溶系统之间的功能失衡。纤溶酶原激活物抑制剂1型（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）是一种重要的调节剂，通过抑制纤维蛋白溶解激活剂组织型纤溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activator，tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator，uPA）在溶解血栓中发挥作用，其不仅抑制血管中的纤维蛋白溶解，而且还参与细胞黏附和迁移的调节[5]。血小板聚集率是DVT的重要表达部分，当循环血小板在某些病理情况下遇到细胞外基质成分时，就会发生血小板活化和凝血酶生成[6]。PAI-1基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）对基因表达和转运蛋白转运产生影响，从而影响下肢DVT的易感性。目前关于PAI-1基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢DVT的影响的研究鲜有报道。因此，本研究旨在探讨PAI-1基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢DVT影响的机制，以便在临床早期诊断中提供理论依据及为临床治疗提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2020年2月～2023年2月于张家口市第一医院就诊的下肢DVT患者80例为观察组，另选80例健康者为对照组。纳入标准：①观察组均符合下肢DVT的诊断标准，对照组均为健康者；②患者的病历完整，可用于数据分析；③自愿参加本研究及同意签署知情同意书。排除标准：①受试者临床资料不全；②正服用溶栓类药物的患者；③其他明确的免疫系统疾病，如强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮；④血液流变性疾病，如骨髓瘤、血友病、瓦尔登斯特伦病、真性红细胞增多症。两组在性别、年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、恶性肿瘤史、心血管疾病史比较，差异均无统计学意义（t/χ2=0.069～0.865，均P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 人纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），DNA快速提取试剂盒（徐州赛恩生物试剂有限公司），ADP试剂（美国biopool公司），TYXN-91智能血液聚集仪（上海通用医用仪器公司），ABI7500 多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪（美国ABI公司），JY600+电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），JS-780A全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：清晨抽取患者入组时空腹静脉血8 ml，其中3 ml枸橼酸钠抗凝，3 000 r/min离心15 min分离血浆，PAI-1水平通过酶联免疫吸附法检测，严格按照试剂说明进行操作；另外2 ml枸橼酸钠抗凝，在4℃下以700 g离心15 min抽取上部血浆制备贫血小板血浆，在4℃下以700 g离心10 min抽取上部血浆制备富血小板血浆，ADP试剂作为诱导剂使用TYXN-91智能血液聚集仪检测血小板聚集率。剩下的3 ml放置于无菌EDTA管抗凝，上下颠倒充分混匀，-80℃冰箱保存备用，用于PAI-1 4G/5G位点SNP分析。

1.3.2 收集患者一般资料及相关实验室检查结果：包括血小板计数、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、三酰甘油（triglycerides，TG）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白-胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、载脂蛋白A1（apolipoprotein A1,apoA1）和载脂蛋白B(apolipoprotein B1,apoB1)水平。

1.3.3 PAI-1 4G/5G位点基因多态性检测：采用DNA提取试剂提取基因组DNA，并检测其浓度和纯度，将A260nm/A280nm比值在1.7～1.9范围内的DNA样本保存备用于-20℃冰箱内。基因点位筛选依照基因分型结果，通过Haploview 4.3软件，依照r2≥0.8，且最小等位基因频率＞0.1标准，选取PAI-1 4G/5G基因标签SNP位点。利用PCR扩增目的基因。引物序列如下：PAI-1u：5’-AAGCTTTTACC ATGGTAACCCCTGGT-3’；PAI-2d：5’-TGCAGCCA GCCACGTGATTGTCTAG-3’；PAI-5G：5’-GTCTGG ACACGTGGGGG-3’；PAI-4G：5’-GTCTGGA CACGTGGGGA-3’。反应体系：100 ng基因组DNA，14μl 4×PCR缓冲液，30 mmol /L MgCl2，10 μmol/L引物，1.10 U Tag酶（天根公司，北京）。反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 min，65℃ 10 min，63℃ 23 min，72℃ 23 min，启动PCR反应。将4G （139 bp）和5G（140 bp）特异性扩增的PCR产物与257 bp对照条带在溴化乙啶染色的2g/dl琼脂糖凝胶上进行检测。通过酶切反应可知PAI-1存在三种基因型：野生4G4G，杂合突变4G5G和纯合突变5G5G。15g/L琼脂糖凝胶电泳：180V 20min。扩增产物通过ABI 3500测序仪进行测序，并与标准序列进行比对，采用Sequencing Analysis 5.4版软件进行基因突变结果分析。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0软件数据分析。使用百分比（%）描述计数资料，采用χ2检验；使用平均数±标准差（±s）描述计量资料，采用t检验：通过Hardy-Weinberg检验遗传平衡（P＞0.05为符合）；采用多因素Logistics回归分析DVT的影响变量P＜0.05为差异有统计学意义。通过交互作用系数γ分析血小板聚集率与PAI-1 4G/5G位点基因多态性的交互作用。

2 结果

2.1 两组实验室指标比较 见表1。与对照组比较，观察组患者的血小板计数水平降低；D-二聚体、PAI-1，卧床时间、血小板聚集率水平均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。其余指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 观察组和对照组的实验室检查指标比较（±s）

表1 观察组和对照组的实验室检查指标比较（±s）

项目观察组（n=80）对照组（n=80）tP TG（mmol/L）1.71±0.641.52±0.981.4520.148 TC（mmol/L）4.52±0.834.45±0.890.5140.608 HDL-C（mmol/L）1.38±0.351.32±0.341.1000.273 LDL-C（mmol/L）2.44±0.672.26±0.631.7510.082载脂蛋白A1（g/L）1.26±0.231.22±0.241.0760.283载脂蛋白B（g/L）0.97±0.200.95±0.210.6170.538 PT（s）11.45±0.8711.32±1.020.8670.387 APTT（s）25.26±3.1425.54±4.130.4830.630 TT（s）17.51±1.7317.38±1.740.4740.636 D-二聚体（mg/L）0.96±1.270.45±1.262.5500.012 PAI-1（mg/ml）33.26±10.1215.14±8.5612.227＜0.001血小板计数（×1012/L）189.56±51.27209.16±71.911.9850.049血小板聚集率（%）55.25±15.5635.75±16.237.757＜0.001卧床时间（h）4.12±1.202.32±0.7811.249＜0.001

2.2 PAI-1基因多态性分析和Hardy-Weinberg平衡检验 野生型4G4G纯合子的终产物为139 bp一条带，变异型5G5G纯合子的终产物为257bp和140bp两条带，杂合子4G5G的终产物为139 bp，140 bp和257 bp三条带。测序结果用Sequencing Analysis 5.4版软件进行对比，共发现1个SNP位点，PAI-1 4G/5G基因一致性为100%。经Hardy-Weinberg平衡检验，PAI-1 4G/5G各基因型分布符合要求（P＞0.05），这提示纳入样本具有代表性。

2.3 两组PAI-1基因多态性位点基因型及等位基因频率分布比较 观察组PAI-1 4G/5G基因型4G4G，4G5G，5G5G基因频率分别为41.25%，47.50%和11.25%，对照组分别为12.50%，67.50%和20.00%，差异有统计学意义（χ2=17.045，P＜0.001）。观察组PAI-1 4G/5G等位基因4G，5G频率分别为65.00%和35.00%，对照组分别为46.25%和53.75%，差异有统计学意义（χ2=11.394，P＜0.001）。

2.4 观察组不同基因型患者血小板聚集率比较 与5G5G基因型患者相比，基因型4G5G，4G4G患者的血小板聚集率依次升高（35.25%±12.55% vs 45.78%±13.45%，56.48%±15.26%），差异有统计学意义（t=4.297，P＜0.001）。

2.5 PAI-1位点基因多态性和血小板聚集率与下肢DVT易感性的关系 见表2。以是否发生下肢DVT作为因变量（否=0，是=1），将PAI-1 4G/5G位点基因型、等位基因频率、血小板聚集率作为自变量，Logistic回归分析显示，PAI-1 4G/5G位点基因型4G4G（OR=5.347，95%CI：1.797～18.124）、携带等位基因4G（OR=4.345，95%CI：1.805～16.252）和血小板聚集率（OR=5.647，95%CI：1.845～22.148）是下肢DVT的独立危险因素（均P＜0.05）。

表2 PAI-1 4G/5G位点基因多态性与下肢DVT易感性的关系

2.6 PAI-1基因多态性与血小板聚集率的交互作用 见表3。PAI-1 4G/5G位点基因型4G4G单独所致下肢DVT易感性的OR为7.785，血小板聚集率所致下肢DVT易感性的OR为6.715；二者同时存在时，交互作用OR为22.324，γ为1.681，提示在下肢DVT易感性中呈正向交互作用（3.135＜1.864×2.024，为次相乘模型）。

表3 PAI-1 4G/5G基因多态性与血小板聚集率的交互作用

3 讨论

下肢深静脉血栓（DVT）形成是一种在下肢深静脉中形成血凝块的疾病，造成血流受阻，引起患肢肿胀、局部疼痛和静脉曲张，还可能导致肺栓塞，是继心脏病发作和中风后心血管疾病死亡的第三大常见原因[7]。睡眠和静卧期间，血流速度变慢，血流淤积，加上人体脆弱的血管壁，容易发生DVT[8-9]。在外科手术后的患者中，发生DVT的风险也相对较高。对于疑似DVT患者，建议结合临床验前概率评估、D-二聚体检测和影像学检查进行诊断[10]。鉴于遗传因素在疾病发病机制中的关键作用，SNP已成为当前研究的热点[11]。目前研究PAI-1基因多态性与血小板聚集率交互作用对下肢DVT影响的文章鲜有报道。因此，本研究探讨DVT患者有关影响因素及PAI-1基因多态性，旨为DVT早期诊断、治疗及发病机制的研究提供实际的理论依据。

当有DVT时，纤维蛋白会分解，产生D-二聚体[12]。因此，高水平的D-二聚体可以提示DVT的存在。除此之外，血小板计数水平是检测DVT的重要指标之一。DVT患者的血小板计数水平通常会降低，当发生DVT时，血小板会聚集在血栓上，导致血小板数量减少。目前研究表明，血小板聚集率与多种疾病的发生及进展密切相关，如DVT，冠心病、脑卒中、高血压等。因此，研究血小板聚集率对于这些疾病的早期诊断及治疗具有重要意义。血小板聚集率是指血小板在接触到损伤的血管壁时，通过细胞膜上的黏附蛋白和受体，发生黏附、聚集并产生黏附介质的过程。血小板聚集率还与体内氧化应激水平密切相关，血小板聚集率的升高反映了体内氧化应激水平增加，导致DVT疾病的发生。

纤溶酶原激活物抑制剂1型（PAI-1）位于染色体7q上，编码含有402个氨基酸的分泌蛋白，一种抑制纤维蛋白溶解的蛋白质，DVT时PAI-1水平会增加，抑制纤维蛋白溶解，从而增加血栓的稳定性。卧床时间长也是引起DVT的重要因素，长期卧床或长时间静止会导致血液循环不畅，容易发生DVT疾病[13-14]。PAI-1基因在人类体内的表达也受到许多因素的调节，如生长激素、胰岛素、细胞凋亡因子和炎性介质等。过去几十年中，关于PAI-1基因的研究涉及到了其在许多疾病中的作用，如心血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病和肝病等，其中研究的深入程度和成果也在逐步加深。作为组织型和尿激酶型纤溶酶原激活剂的主要抑制剂，PAI-1是纤维蛋白溶解系统的组成部分[15]。异常升高的PAI-1会损害纤溶酶原的活化，导致血管中纤维蛋白过度积累，从而进一步导致DVT。纤维蛋白原，称为凝血因子I，是一种由肝脏合成的急性期蛋白质。它在凝血酶的作用下被激活成纤维蛋白，在身体的凝血过程中是必不可少的。纤维蛋白原升高会增加血液粘度，促进血小板聚集，并加重DVT[16]。

本研究结果显示，PAI-1基因4G/5G位点多态性分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示所选样本具有代表性。DVT与年龄、损伤机制、ASA评分、机械通气、CRP，血小板计数、D-二聚体、多发性损伤、延长住院时间以及从受伤到手术的时间超过2周有关[17]。血小板也是血栓形成的关键因素。血小板可参与血管内皮炎症反应及纤维蛋白的形成，从而导致血栓形成。血小板消耗抗体可降低血浆中促炎细胞因子的水平，输注血小板可恢复细胞因子水平。血小板黏附之后立即出现血小板活化、颗粒分泌、聚集和血浆凝血[18-19]。由于其抗黏附性，血小板在内皮附近循环而不会形成任何稳定的黏附接触。然而，在某些生理病理情况下，它们变得异常多动[20]并导致血管内形成凝块，导致DVT并增加心脑血管并发症的发生率。血小板聚集率水平升高是因为在DVT过程中，血小板会聚集并黏附在已有的血小板上，形成DVT。因此，血小板聚集率水平的升高可以提示DVT的存在。纤维蛋白溶解系统的损伤在血栓性疾病的进展中起着重要的作用。本研究还发现，PAI-1基因4G4G位点基因型和携带等位基因4G，以及血小板聚集率，都是下肢DVT的独立危险因素，其中4G4G基因型的风险比最大。在下肢DVT的形成过程中，血小板可以促进凝血过程，并在血管内壁损伤后黏附聚集，形成DVT。因此，高血小板聚集可能会增加下肢DVT的风险。在PAI-1基因多态性中，4G4G基因型和携带等位基因4G可以影响PAI-1基因的表达，从而影响凝血和纤溶功能的平衡。另一方面，其遗传多态性在血栓性疾病中的作用越来越受到关注。研究表明，PAI-1基因多态性(4G4G型)是心血管疾病和深静脉血栓形成的患病风险因素之一，这是因为过多的PAI-1会抑制纤溶酶原激活剂的活性，从而导致血栓形成。PAI-1基因多态性(4G4G型)是指PAI-1基因第7内含子中含有4个鸟嘌呤和4个胞嘧啶，这种基因型表现为PAI-1蛋白的合成量和释放量增加，因而增加了血液中PAI-1的水平。最近的一项meta分析显示，PAI-1 4G/5G多态性与DVT风险增加有关，尤其是在亚洲人群中[21]。

交互作用是一种临床疾病评估常用的方法，通过对两个指标间的交互作用进行定量分析。以往的研究发现[22]，血小板聚集率与多种基因位点的多态性之间存在协同交互作用。目前对于PAI-1基因4G/5G多态性与血小板聚集率在DVT中的交互作用还没有被深入研究。本研究发现，PAI-1（4G4G）基因型和血小板聚集率之间存在正向交互作用，显著增加了DVT发病的风险。血小板聚集率和PAI-1（4G4G）型对DVT的发生风险有相互显著放大效应，这提示PAI-1的4G等位基因为DVT的危险基因，携带PAI-1（4G4G）基因型者血小板聚集率越高危害效应越大。因此，本研究猜想由于血小板聚集率异常，提示DVT患者的血小板水平控制不佳，为DVT的发生创造了条件。而携带PAI-1（4G4G）的患者体内激素水平紊乱，增加DVT的发生风险。

本文局限性：本研究所纳入样本数量较少，血栓形成的发病机制复杂，影响的因素也很多，本研究未完全纳入，样本选择受制于地区、例数、人群，需进一步扩大地区、扩大样本进一步证实PAI-1基因突变与血小板聚集率的交互作用与DVT的关系。对此，我们将在未来研究中进一步证实本研究的分析结果。

综上所述，DVT的高危人群均携带PAI-1（4G4G）基因型。PAI-1（4G4G）基因型与血小板聚集率的交互作用增加了DVT的发病和发展风险。临床可以通过控制血小板聚集率和基因调控来预防DVT的发生。