非小细胞肺癌患者血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表达及与预后相关性研究

巫旋钦，陈 庚，贾 砚，阳 鹏，陈中良

[中国科学院大学深圳医院（光明）心胸血管外科，广东深圳 518106]

肺癌的发病率和死亡率在全世界所有恶性肿瘤中最高，其中80%～85%的组织学类型被诊断为非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC），且大多数患者在肺癌晚期才被诊断出来，最佳治疗的时机被延迟，导致肺癌患者的预后仍然不尽如人意[1-2]。因此，寻找可尽早识别NSCLC的生物标志物，对改善NSCLC预后、提高国民健康有重要意义。据报道，肿瘤自身抗体（autoantibodies，AABs）在成为癌症生物标志物方面具有较大潜力，其不但在临床诊断早期可检测到，在癌症转移时其表达也能被发现，因此AABs可能成为NSCLC早期诊断和预测患者预后最有潜力的生物标志物[3]。研究表明，角蛋白5抗体（cytokeratin 5 antibody，anti-CK5）、P63抗体（P63 antibody，anti-P63）和甲状腺转录因子-1抗体（thyroid transcription factor 1 antibody，anti-TTF-1）在肺腺癌中发挥重要作用[4]。然而，NSCLC患者血清中是否存在CK5，P63和TTF-1的相应抗体，以及这些抗体对NSCLC的诊断价值鲜有报道。本研究通过检测NSCLC患者中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1的表达水平，分析其与NSCLC预后的关系，旨在为临床中NSCLC的早期诊疗和预后提供研究方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年6月～2017年6月在中国科学院大学深圳医院接受治疗的80例NSCLC患者的随访记录，将其设为NSCLC组。NSCLC组男性45例，女性35例，年龄58.99±15.74岁。纳入标准：①患者在临床中确诊为NSCLC[5]；②NSCLC分期包括不能进行切术手术的III～IV期患者；③未进行任何抗肿瘤治疗的患者；④临床基本资料完善的患者。排除标准：①并发其他肿瘤者；②并发免疫性疾病者；③并发血液性疾病者；④随访失联或不配合者。另外纳入80例肺炎患者为肺炎组（良性病变）和同期健康体检者80例为对照组。肺炎组男性44例，女性36例，年龄59.27±14.33岁；对照组男性42例，女性38例，年龄59.61±14.28岁。三组研究者一般资料比较差异均无统计学意义（F/χ2=0.035，0.235，P＞0.05），具有可比性。该研究经本院伦理委员会批准，研究对象均知情同意并书面确认。

1.2 仪器与试剂 anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（科威生物技术有限公司）；酶标仪（BioTek Instruments,USA）

1.3 方法 对照组在体检时，NSCLC组在患者入院确诊时抽取静脉血5 ml，3 000 r/min离心后，将得到的血清立即储存于-80℃冰箱中待测。采用ELISA方法检测血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1的水平。具体操作严格按照试剂盒说明书进行，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

1.4 随访 术后通过电话访问、门诊复查等形式对全部患者进行为期5年的随访，全部病例无失访，统计随访期间患者生存情况。按生存情况分为预后良好（生存）组（n=19）和预后不良（死亡）组（n=61）。

1.5 统计学分析 所有数据均使用SPSS 25.0软件完成统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验；采用COX回归分析NSCLC预后的影响因素。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1及其联合检测对NSCLC患者预后的预测效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TF-1水平比较 见表1。单因素方差分析显示，肺炎组和NSCLC组患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），NSCLC组患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平高于肺炎组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 三组血清中anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平比较（±s）

表1 三组血清中anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平比较（±s）

注：＃与对照组比较，t=3.619,7.451,4.612; 8.117,4.367,11.022,均P＜0.05；*与肺炎组比较t=3.832,3.505,6.655,均P＜0.05。

项目 对照组（n=80） 肺炎组（n=80） NSCLC组（n=80） F P anti-CK5（pg/ml） 140.01±46.31 158.79±46.51＃ 178.68±46.44＃* 13.883＜0.001 anti-P63（ng/ml） 2.02±0.43 2.18±0.50＃ 2.36±0.52＃* 16.572＜0.001 anti-TTF-1（ng/ml） 2.26±0.44 2.41±0.42＃ 2.73±0.43＃* 30.809＜0.001

2.2 血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1对NSCLC的诊断价值 见图1、表2。以NSCLC患者血清anti CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平为检验变量，以是否发生NSCLC为状态变量（否=0，是=1）绘制ROC曲线，结果显示，血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平及三者联合预测NSCLC发生的AUC分别为0.725，0.710，0.735和0.852，其中联合预测AUC显著高于三者单独预测AUC，差异具有统计学意义（Z=2.500，2.795，2.378，P=0.012，0.005，0.021），且三者联合具有较高的敏感度和特异度。

图1 血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平预测NSCLC发生的ROC曲线

表2 血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平预测NSCLC发生的价值

2.3 不同预后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比较 见表3。单因素方差分析显示，NSCLC死亡组患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均高于生存组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 不同预后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比较（±s）

表3 不同预后NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平比较（±s）

项目 生存组（n=19） 死亡组（n=61） F P anti-CK5（pg/ml） 163.00±42.66 183.57±47.45 3.820＜0.001 anti-P63（ng/ml） 2.18±0.39 2.41±0.40 2.201 0.031 anti-TTF-1（ng/ml） 2.51±0.39 2.80±0.46 2.481 0.015

2.4 临床病理特征与NSCLC患者anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平的关系 见表4。经独立样本t检验分析显示，NSCLC患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表达均与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤部位无关，差异无统计学意义（均P＞0.05）。吸烟的患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表达显著高于不吸烟的患者，差异具有统计学意义（均P＞0.05）；T分期中，T1～T2期患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表达显著低于T3～T4期患者，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；N分期中，N0期患者anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平表达显著低于N+期患者，差异具有统计学意义（均P＜0.001）。

2.5 NSCLC患者预后影响因素的COX回归分析 见表5。以吸烟史（不吸烟=0，吸烟=1）、T分期（T1～T2期=0，T3～T4期=1）、N分期（N0=0，N+=1）、anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平为自变量，以预后（不良=1，良好=0）为因变量，进行单因素COX回归分析。结果显示，以上6个因素均对NSCLC患者预后有影响（P＜0.05）。多因素分析发现，T分期[HR（95%CI）=1.443（1.106～2.254）]、N分期[HR（95%CI）=1.375（1.185～1.820）]、anti-CK5[HR（95%CI）=1.518（1.133～2.286）]，anti-P63[HR（95%CI）=1.771（1.255～2.388）]和anti-TTF-1[HR（95%CI）=2.012（1.672～2.921）]水平均是影响NSCLC患者预后的独立危险因素（均P＜0.05）。

2.6 NSCLC患者anti-CK5，anti-P63和anti-TF-1水平预测不良预后的价值分析 见图1、表6。以NSCLC患者血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平为检验变量，以预后结果为状态变量（生存=0，死亡=1）绘制ROC曲线，结果显示，血清anti-CK5，anti-P63，anti-TTF-1水平及三者联合预测NSCLC患者预后结局的AUC分别为0.773，0.741，0.729和0.880，其中联合预测AUC显著高于三者单独预测AUC（Z=3.834，3.868，3.686,P=0.043，0.032，0.028）。

表6 血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平预测NSCLC患者预后结局的价值

3 讨论

在肿瘤发展的进程中，癌细胞会释放出一些特异性蛋白，这些特异性蛋白表达失调后成为肿瘤抗原[6]。癌细胞的抗原变化可以被患者自身的免疫系统识别，并表现为对参与恶性转化的因素的免疫反应。而自身抗体被称为来自免疫系统的“报告者”，可以识别参与转化过程的细胞因子的抗原变化[7]。肿瘤相关的自身抗体是一组血清生物标志物，不但在血液样本中容易获得，而且具有较长的半衰期，这比目前使用的其他蛋白质生物标志物具有优势[8]。此外，抗体对抗原的扩增反应意味着在肿瘤发生的早期阶段，即使相对少量的抗原也可以引发更大的免疫反应，这使其成为一种有用的早期诊断标志物[8]。相较于CT检测，癌症患者血液中的自身抗体能够提前5年发现肿瘤，且血液中自身抗体的联合检测更为有效，对早期癌症的筛查价值较大[6]。因此，本研究探寻可靠的自身抗体对NSCLC进行诊断意义重大。

CK5被认为是中等分子量的细胞角蛋白，由于其在基底细胞中的表达，也被称为基底细胞角蛋白[9]。GUDI等[10]人表明，在诊断各种病变乳腺组织时，anti-CK5对病变组织的诊断效果优于anti-CK5/6，在常规临床使用中具有较高的诊断和经济效益。TERADA等[11]人发现CK5是肺鳞状细胞癌（ADC）的独立不良预后因素，阳性CK5对ADC表现出侵袭性临床行为。p63是上皮发育的主要调节因子，许多小鼠和人类研究显示可驱动肿瘤发生[12]。LÉPINE等[13]人发现anti-P63的免疫化学是预测复发性呼吸道状瘤病严重程度的潜在生物标志物。TTF-1是一种参与肺胚胎发育的转录蛋白。它有助于表面活性剂的产生、呼吸单位和肺泡的发育以及正常的肺功能，同时具有癌基因和肿瘤抑制特性[14]。SHARMA等[15]人认为在ADC中TTF-1的特异度为88.2%，p63的特异度为93.8%。也有研究表明，TTF-1在肺腺癌均具有较高的阳性预测值和诊断准确性，而CK5和p63对肺鳞状细胞癌具有较高的阳性预测值和准确性[16]。此外在回顾性分析中发现，使用anti-TTF-1抗体快速免疫组织化学法对肺腺癌的诊断中有帮助[17]。已研究表明，CK5，P63和TTF-1三种抗原在NSCLC中表达，因此本实验中研究anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1这三种自身抗体在NSCLC中的表达情况。本研究结果表明，NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平明显高于对照组受试者和肺炎患者，这一结果与上述研究结果基本一致[11,15]，提示三者的表达升高,参与NSCLC的发生。ROC曲线结果显示，血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1联合预测NSCLC发生的诊断效能明显升高。且联合预测的敏感度和特异度分别为78.75%和85.00%，提示anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1对NSCLC的发生有一定诊断价值。本研究进一步探究NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1与患者预后的相关性，结果显示，死亡组患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平明显高于生存组患者，且NSCLC患者血清三者指标表达水平与患者吸烟史、T分期和N分期均有关，这一结果与MU等[18]人研究结果类似，提示血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1高表达可能是NSCLC患者预后不良的分子标志。进一步通过ROC曲线预测显示，三者联合对NSCLC患者预后预测具有良好的临床价值，且COX回归分析显示T分期、N分期以及anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1水平均是影响NSCLC患者预后的独立危险因素，这一结果与CHENG等[19]结果基本一致，提示血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1可作为预测NSCLC预后不良的辅助生物检测手段，及早预估预后不良的发生风险，降低NSCLC的死亡率，表明血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1在NSCLC的诊断与预后评估中具有重要的临床价值。但本研究纳入样本量有限，且影响NSCLC预后的因素众多，后续本研究还需进一步探究血清anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1与NSCLC患者预后的关系并探讨其在NSCLC发生中的作用机制，为三者作为NSCLC患者预后标志物提供更有利的理论依据。

综上所述，NSCLC患者血清中anti-CK5，anti-P63和anti-TTF-1表达升高，且均是NSCLC患者预后的独立危险因素，三者联合对NSCLC患者预后的结局具有较好的预测价值。作为临床上检测的辅助手段，AABs的特异性及先于症状出现的特征可对NSCLC患者早干预，进而达到积极防治，改善NSCLC预后的目的。但本研究中样本量较小，可能使结果具有局限性，后期将使用大样本量对其具体机制进行深入研究。