成人噬血细胞综合征患者血浆IL-6，IL-8和IL-10水平分析及其与预后的相关性研究

武 坤，马晓波，杨金荣，聂 波，周 强，程沈菊，罗 珊，曾 云

（1.云南省检验医学重点实验室，昆明 650032；2.云南省医学检验临床医学研究中心，昆明 650032；3.昆明医科大学第一附属医院 a.医学检验科；b.血液科，昆明 650032; 4.云南省血液病研究中心，昆明 650032）

噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome,HPS）是一种临床危重综合征，主要由遗传、获得性免疫缺陷、重症感染等导致的无法控制的过度炎症引起，临床表现为发热、脾肿大、淋巴结病、黄疸、皮疹、三酰甘油和铁蛋白水平升高、纤维蛋白原水平降低等[1]。HPS与败血症、多脏器衰竭等疾病症状相似，临床表现不具有特异性，并且病情进展迅速，因此该病的诊断、治疗成为临床难点[2]。HPS通常伴有免疫细胞异常活化，HPS的潜在机制之一是T淋巴细胞、自然杀伤细胞介导的细胞毒性受损，进而引起抗原驱动的继发免疫系统激活，释放大量细胞因子，造成“因子风暴”，对患者造成重大打击[3]。由于细胞因子之间、细胞因子与免疫细胞之间均存在复杂的作用机制，因此IL-6，IL-8和IL-10等细胞因子被认为是HPS进展的关键因素[4]。本研究对成人HPS患者免疫活细胞、细胞因子水平进行测定，并分析其临床意义，以期为成人HPS诊断、治疗研究提供新方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年1月～2021年1月入昆明医科大学第一附属医院收治的HPS患者60例为研究对象，其中男性36例，女性24例，中位年龄47（23～74）岁。纳入标准：①患者符合国际组织细胞协会修订的《HLH-2004诊断和治疗指南》的诊断标准[5]；②年龄＞18周岁；③临床资料完整者。排除标准：①儿童HPS；②不同意参加本研究者。另选取120例健康成人作为对照组，其中男性65例，女性55例，中位年龄44（25～77）岁。HPS组和对照组间一般资料相比较差异无统计学意义（t=8.927,均P＞0.05），具有可比性。该研究已经过本院伦理委员会批准，且获得所有研究对象的知情同意。

1.2 仪器与试剂 CD3-APC，CD56-PE，CD8-PE/cy7，CD28-FITC，CD14-FITC和CD64-PE等抗体（美国BD公司）；细胞因子（IL-6，IL-8，IL-10）检测试剂盒（青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司）；FACSCantoIITM流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 检测方法：使用EDTA，无抗凝剂采血管采集患者和对照组人群空腹静脉血（4ml/管），EDTA抗凝管用于细胞分类计数，无抗凝剂采血管收集血清标本用于细胞因子水平测定。使用FACSCantoIITM流式细胞仪检测外周血自然杀伤细 胞（naturalkillcell，NK cell,CD3-/CD56+）、细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL,CD3+/CD8+/CD28+）和单核细胞（monocyteCD14+/CD64+）的数量，及细胞因子（IL-6，IL-8，IL-10）水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 临床资料收集：收集HPS患者的一般资料、症状和体征，一般资料主要包括年龄和性别，体征主要包括体温、肝脾淋巴结肿大情况、皮疹、黄疸、浆膜腔积液及各系统累犯情况等。随访资料为总生存时间（患者开始治疗至死亡或末次随访的间隔时间）。

1.3.3 评价指标：比较HPS组、对照组免疫活细胞和细胞因子水平。根据患者处于急性期或缓解期分为急性期组、缓解期组，根据患者结局分为存活组、死亡组，比较细胞因子水平差异。比较总生存时间差异。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析；采用Kaplan-Meier法分析细胞因子表达水平与患者生存时间的关系；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPS患者的临床症状和体征 在60例成人HPS患者中，出现发热症状的患者60例（100%），肝脾肿大51例（85.0%），浅表淋巴结肿大22例（36.7%），呼吸系统症状31例（51.7%），消化系统症状10例（16.7%），神经系统症状6例（10.0%），黄疸19例（31.7%），皮疹7例（11.7%）。

2.2 HPS组和健康组免疫活性细胞水平比较 成人HPS患者NK细胞（CD3-/CD56+）的检出率（15.59%±2.81%）低于健康对照人群（23.92%±3.92%），差异有统计学意义（t=12.969，P=0.000）；CTL细胞（31.07%±3.29%）和单核细胞（7.59%±1.84%）检出率均高于健康组（22.53%±5.41%，5.16%±1.72%），差异具有统计学意义（t=11.224，8.728，均P＜0.05）。

2.3 HPS组和健康组细胞因子水平比较 成人HPS患者血浆IL-6（83.2±9.8 pg/ml），IL-8（104.8±14.3 pg/ml），IL-10（211.2±17.3 pg/ml）水平均高于健康组（31.1±7.4 pg/ml，16.5±4.3 pg/ml，26.9±1.9 pg/ml），差异具有统计学意义（t=39.824，62.382，115.630，均P＜0.01）。

2.4 急性期和缓解期HPS患者细胞因子水平比较 急性期HPS患者血浆IL-6（99.8±7.5pg/ml），IL-8（127.6±12.9pg/ml）和IL-10（294.9±24.1pg/ml）水平均高于缓解期（69.1±4.1pg/ml，84.8±6.6pg/ml，137.9±7.7pg/ml），差异具有统计学意义（t=20.004，16.477，34.908，均P＜0.05）。

2.5 细胞因子水平与HPS预后之间的关联 死亡组患者IL-6（125.1±16.7pg/ml），IL-8（193.9±25.8 pg/ml）和IL-10（474.7±65.3pg/ml）显著高于存活 组（75.8±6.3pg/ml，89.2±9.0pg/ml，164.7±18.7pg/ml），差异具有统计学意义（t=15.994，22.777，28.747，均P＜0.05）

采用Kaplan-Meier法分析血浆IL-6，IL-8和IL-10水平与患者生存时间的关系，以IL-6，IL-8，IL-10中位值分为高水平、低水平。结果显示，IL-6高表达的HPS患者中位总生存时间（16.4±2.8月）低于低表达患者（24.7±5.3月），差异有统计学意义（t=7.229，P＜0.05），见图1A。IL-8高表达的HPS患者中位总生存时间（14.7±3.8月）低于低表达患者（24.0±1.7月），差异有统计学意义（t=23.608，P＜0.05），见图1B。IL-10高表达的HPS患者中位总生存时间（30.5±5.1个月）低于低表达患者（55.3±4.7个月），差异有统计学意义（t=35.411，P＜0.05），见图1C。

图1 细胞因子IL-6 (A),IL-8 (B),IL-10 (C)与HPS患者生存时间之间的关联

2.6 HPS患者血浆细胞因子水平随病程的变化 见表1。所有纳入研究的HPS患者，至研究截止有36例获得长期临床缓解（A组），24例处于疾病活动、疾病复发或最终死亡（B组）。两组患者血清IL-6，IL-8和IL-10水平随疾病治疗均有下降的趋势（均P＜0.05）。

表1 HPS患者血浆细胞因子水平随病程的变化（±s,pg/ml）

表1 HPS患者血浆细胞因子水平随病程的变化（±s,pg/ml）

项 目 第0 天 第5天 第10 天 第15天 F值 P值IL-6 A组 75.3±3.5 70.5±3.5 66.1±2.7 59.5±1.2 5.33 0.011 B组 92.7±2.3 88.3±0.4 79.7±3.9 72.1±3.7 IL-8 A组 92.7±0.8 85.6±4.7 77.3±5.5 66.7±2.4 1.244 0.026 B组 122.5±8.1 117.4±5.8 97.3±6.4 91.3±2.9 IL-10 A组 137.3±12.7 114.5±10.6 91.5±8.7 82.8±10.2 3.632 0.003 B组 230.6±9.6 227.9±5.1 185.6±14.2 177.2±7.4

3 讨论

噬血细胞综合征（HPS）发病迅速，进展快，患者预后差，其典型特征是细胞因子介导的巨噬细胞激活和增殖异常，导致无法控制的体内炎症应答[6]。HPS在儿童中更为常见，但是成人HPS发病率呈现逐年升高趋势，据最新的一项流行病学调查结果显示，HPS在中国汉族人群的总体发病率约为1.04/10万，其中成人患者约为35%[7]。HPS无典型的临床症状，误诊、漏诊率高，临床治疗难度大[8]。HPS的发生、进展与活化T细胞、巨噬细胞分泌大量细胞因子密切相关[7]。当机体发生严重感染时，机体免疫系统发生紊乱，导致免疫细胞过度激活并产生大量细胞因子，如：IL-6，IL-10，IL-8等，导致巨噬细胞活化，活化的巨噬细胞进而分泌更多细胞因子，造成“细胞因子风暴”[8-9]。高水平细胞因子是HPS的主要病理特征。因此，分析成人HPS患者体内细胞因子水平，有助于进一步明晰该病发病机制和寻找针对性治疗靶点。

本研究首先对患者的临床症状和体征进行分析，结果显示成人HPS患者不同程度地出现发热、肝脾肿大、浅表淋巴结肿大、呼吸系统症状、消化系统症状、神经系统症状、黄疸和皮疹等临床特征，这与以往文献[10]报道一致。HPS是一种以体内过度炎症应答为特征的临床综合征，其首发症状通常是非特异性的，持续不明原因的发热、肝脾肿大和血细胞减少被认为是HPS的三联征，而这些症状与免疫细胞异常活化、细胞因子分泌增多关系密切[11]。当前观点认为，HPS患者通常出现免疫功能调节异常，免疫细胞的增殖、活化及凋亡作用减弱，使体内病原体不能被及时清除，免疫反应异常活跃，免疫系统会对正常细胞进行“错杀”，加重机体损伤[12-13]。在本研究中，我们发现成人HPS患者NK细胞检出率明显下降，而CTL细胞和单核细胞检出率明显升高，提示在成人HPS患者NK细胞活化受到抑制，而CTL细胞、单核细胞则被异常激活。

成人HPS的主要原因是脓毒血症[12]。此外，免疫细胞异常激活，会导致细胞因子大量释放[13]。细胞因子可以通过多种途径促进免疫反应过度激活，驱动HPS的发生、进展。IL-6主要来源于单核巨噬细胞，可以激活细胞内促炎信号，增强T细胞迁移能力和细胞毒性，抑制Treg细胞分化[14]。在病毒诱发的HPS患者中，IL-6水平通常较低，而由自身系统性炎症应答诱发的HPS则IL-6呈高表达状态[15]。IL-10是由Th2细胞产生，可以活化细胞毒性T细胞、B细胞，具有免疫调节作用[16]。IL-8是中性粒细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞的引诱剂和激活剂，可由上皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多种细胞产生，IL-8过度分泌是机体严重炎症反应的关键环节。这些细胞因子持续分泌进入血液循环，加之免疫细胞的异常活化，最终引起组织损伤和多器官功能衰竭。本研究结果显示，成人HPS患者IL-6，IL-8和IL-10水平显著升高，提示患者体内存在严重炎症反应。此外，本研究还发现急性期患者细胞因子水平要明显高于缓解期患者。这些结果提示炎症因子可能是该病诊断、治疗的潜在靶标。

HPS是致死率较高的炎症综合征，患者预后较差。本研究进一步探讨了细胞因子与患者预后的关系。结果显示，患者缓解后IL-6，IL-8和IL-10水平均出现下降，一方面表明细胞因子升高可能是HPS病情加重的因素之一；另一方面也提示细胞因子水平可作为患者病情缓解的可靠指标。另外，本研究还发现死亡组患者IL-6，IL-8和IL-10水平明显高于存活组患者，且高水平细胞因子患者生存时间低于低水平患者。这些结果提示，细胞因子IL-6，IL-8和IL-10可作为判断成人HPS患者病情严重程度及预后的指标。

综上所述，成人HPS患者NK细胞活化受到抑制，而CTL细胞、单核细胞则被异常激活，IL-6，IL-8和IL-10水平明显升高。高水平IL-6，IL-8和IL-10提示成人HPS患者预后不佳。但本研究收集病例数较少，对疾病病因的研究还不够深入，在后续研究工作中，我们将继续积累病例，进一步验证这些细胞因子在成人HPS中的作用，深入阐明HPS发病的分子生物学机制。