IgA肾病患者血清miR-346和SFRP-4水平表达与病情严重程度及预后的相关性研究

赵 玲，金巧玲，黄 俊，高 兴，宿 林（1.成都市第六人民医院a.肾内科；b.药物临床实验I期病房，成都 610051；.四川大学华西第四医院肾内科，成都 610041）

IgA肾病是临床上最常见的原发性肾小球疾病，通常表现为肾小球系膜区IgA沉积[1]。IgA肾病呈慢性进行性发展，约10%～20%的患者在确诊10年后逐渐进展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD），给患者及其家属造成了巨大的身心伤害[2]。因此，探寻与IgA肾病进展有关，且可预测IgA肾病患者预后的指标，对改善IgA肾病患者预后极为重要。既往研究发现，炎症反应在IgA肾病的发病中发挥重要作用[3]。微小核糖核酸（micro RNA,miR）-346作为miRNA家族成员之一，参与多种疾病的炎症反应过程，与慢性肾病的病理生理过程密切相关[4-5]。分泌型卷曲相关蛋白4（secreted frizzled-related protein 4,SFRP-4）作为一种脂肪因子与动脉粥样硬化、糖代谢、炎症反应等密切相关[6]。有研究显示，SFRP-4异常表达与肾功能密切相关[7]。目前关于miR-346，SFRP-4在IgA肾病患者中的研究较少。因此，本研究旨在探讨血清miR-346和SFRP-4水平与IgA肾病患者病情程度及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年3月～2020年1月在成都市第六人民医院接受治疗的102例IgA肾病患者为研究对象，其中男性61例，女性41例，年龄26～55岁。根据肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）程度[8]将IgA肾病患者分为轻度组（n=35，光镜下RIF面积＜25%）、中度组（n=43，光镜下RIF面积25%～50%）和重度组（n=24，光镜下RIF面积＞50%）。轻度组男性20例，女性15例，年龄26～52（35.59±7.91）岁；中度组男性25例，女性18例，年龄27～55（36.21±8.49）岁；重度组男性16例，女性8例，年龄27～58（37.04±8.06）岁。纳入标准：①肾穿刺活检确诊为IgA肾病者；②年龄满18周岁。排除标准：①患有内分泌系统疾病者；②继发性IgA肾病者；③并发恶性肿瘤患者；④存在免疫系统疾病者。同时收集同期在我院进行健康体检的健康者50例为对照组，其中男性26例，女性24例，年龄26～54（36.29±9.68）岁。四组在性别、年龄上差异无统计学意义（χ2=0.835，t=0.007，均P＞0.05），本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 Trizol试剂（上海索莱宝生物）；荧光定量检测试剂盒，反转录试剂盒（日本TAKARA公司）；SFRP-4 ELISA试剂盒（Bioswamp公司）；全自动酶标仪（美国BioTek，Elx808）。

1.3 方法

1.3.1 资料收集与血清样品采集：收集所有研究对象一般临床资料：性别、年龄、血清肌酐（serum creatinine,SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、24h尿蛋白定量、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、清蛋白（albumin,Alb）、尿酸（uric acid,UA）及肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）。抽取IgA肾病患者入院次日晨起及对照组体检当天空腹肘静脉血3～5 ml，血液凝固后分离血清（3 000 r/min，10 min），-70℃冷藏待测。

1.3.2 项目检测：血清miR-346表达水平检测采用实时荧光定量PCR法，Trizol试剂提取血清中总RNA，将总RNA反转录得到cDNA，采用荧光定量PCR仪进行测定，内参基因选择U6，总反应体系20 µl，其中miScript SYBR Green Mix 10 µl，上下游引物各1 µl，cDNA 4 µl，双蒸水4 µl。反应条件：92℃预变性60 s，95℃变性30 s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共42个循环。测定完成后采用2-ΔΔCt法计算miR-346相对表达水平，此实验重复三次，避免实验误差。miR-346引物序列：上游引物5’-GAGTGCCTGCCTCTCTGTTG-3’，下游引物5’-G AGCAGCTCTGCCCAGG-3’；U6引物序列：上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清SFRP-4水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 随访：对102例患者随访三年，主要以电话或门诊的方法进行随访，在随访期间死亡或进展为ESRD纳为预后不良组，生存下来且未进展为ESRD纳为预后良好组。ESRD：开始进行维持性肾脏替代治疗或eGFR降低至15 ml/min/1.73 m2。

1.4 统计学分析 使用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间差异比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验；计数资料以n（%）表示，组间比较行χ2检验；IgA肾病患者血清miR-346，SFRP-4水平与病情程度之间的相关性分析用Spearman分析；采用多元Logistic回归分析影响IgA肾病患者不良预后的因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料对比 见表1。IgA肾病患者SCr，BUN，24h尿蛋白定量、UA水平较对照组升高，且随着病情程度的增加，SCr，BUN，24 h尿蛋白定量，UA水平逐渐升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；IgA肾病患者Hb，Alb，eGFR水平较对照组降低，且随着病情程度的增加，Hb，Alb，UA，eGFR水平逐渐降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 基线资料对比（±s）

表1 基线资料对比（±s）

注：a与对照组相比t=5.674，14.611，24. 306；4.394，11.545，12. 021；2.837，5.534，7. 763；4.139，9.038，10. 537；9.575，12.788，14. 556；5.784，14.206，17.784，均P＜0.05。b与轻度组相比t=7.147，15. 140；6.422，7. 717；9.179，10. 318；2.054，3. 889；4.969，8. 108；3.076，6. 074；7.538，12.063，均P＜0.05。c与中度组相比t=9.039，3.042，2.210，2.084，3.91，3.277，5.741，均P＜0.05。

项 目对照组（n=50）轻度组（n=35）中度组（n=43）重度组（n=24）FP SCr（mmol/L）63.21±18.4390.37±25.73a134.54±28.24ab201.23±30.22abc183.4660.000 BUN（mmol/L）5.67±1.427.22±1.83a10.51±2.54ab12.84±3.71abc66.7950.000 24 h尿蛋白定量（g/24h）-1.48±0.352.83±0.81b3.12±0.97bc46.2810.000 Hb（g/ml）148.34±18.21135.24±24.36a121.84±24.39ab117.52±20.87abc15.9190.000 Alb（g/ml）43.48±7.2237.49±5.49a31.16±5.68ab26.63±4.33abc55.0710.000 UA（µmol/L）260.37±40.58346.59±41.26a378.34±48.39ab419.37±50.49abc88.9200.000 eGFR（ml/min/1.73m2）100.39±12.6784.37±12.42a62.49±13.01ab43.18±13.54abc132.7590.000

2.2 不同病情程度IgA肾病患者血清miR-346，SFRP-4水平对比 见表2。与对照组相比，IgA肾病患者血清miR-346水平降低，血清SFRP-4水平升高，且随着病情程度的增加，血清miR-346水平逐渐降低，血清SFRP-4水平逐渐增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步Spearman相关性分析结果显示，IgA肾病患者病情程度与血清miR-346水平呈显著负相关（r=-0.673，P＜0.05），与血清SFRP-4水平呈显著正相关（r=0.532，P＜0.05）。

表2 不同病情程度患者血清miR-346，SFRP-4水平对比（±s）

表2 不同病情程度患者血清miR-346，SFRP-4水平对比（±s）

注：a与对照组相比t=6.980，11.800，13. 920；8.378，18.094，16.929，均P＜0.05。b与轻度组相比t=3.678，8. 367；8.488，9.631，均P＜0.05。c与中度组相比t=7.845，3.845，均P＜0.05。

项 目对照组（n=50）轻度组（n=35）中度组（n=43）重度组（n=24）FP miR-3461.09±0.230.76±0.19a0.63±0.12ab0.42±0.07abc96.7350.000 SFRP-4（ng/ml）1.32±0.311.90±0.32a2.54±0.34ab2.94±0.51abc147.1710.000

2.3 不同预后IgA肾病患者基线资料及血清miR-346，SFRP 4水平对比 见表3。102例IgA肾病患者中，在随访截止后，有32例患者进入预后不良组，70例为预后良好组，两组在性别、年龄上差异无统计学意义（P＞0.05）。预后不良组患者SCr，BUN，24 h尿蛋白定量，UA，SFRP-4水平高于预后良好组，而Hb，Alb，eGFR，miR-346水平低于预后良好组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 不同预后IgA肾病患者基线资料与血清miR-346，SFRP-4水平对比[±s,n(%)]

表3 不同预后IgA肾病患者基线资料与血清miR-346，SFRP-4水平对比[±s,n(%)]

项 目预后良好组（n=70）预后不良组（n=32）χ2/tP性别（男/女）38/32（54.29）23/9（71.88）2.8260.093年龄（岁）35.78±8.1337.09±8.320.7500.455 SCr（mmol/L）121.68±26.89164.39±29.917.1840.000 BUN（mmol/L）8.85±2.4712.29±2.796.2640.000 24 h尿蛋白定量（g/24h）2.26±0.652.80±0.793.8360.000 Hb（g/ml）132.48±24.15119.56±22.252.4500.016 Alb（g/ml）34.22±5.8228.01±4.175.4260.000 UA（µmol/L）367.36±43.61398.41±52.633.1230.002 eGFR（ml/min/1.73m2）70.41±14.2153.53±10.146.0460.000 miR-3460.71±0.150.43±0.109.6150.000 SFRP-4（ng/ml）2.18±0.352.90±0.419.1280.000

2.4 多因素Logistic回归分析影响IgA肾病患者预后的危险因素 见表4。以IgA肾病患者是否出现预后不良作为因变量（是＝1，否＝0），以SCr，BUN，24h尿蛋白定量，Hb，Alb，UA，eGFR，miR-346，SFRP-4水平为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果显示，SCr，24 h尿蛋白定量，eGFR，miR-346，SFRP-4是IgA肾病患者预后不良的独立危险因素（均P＜0.05）。

表4 多因素Logistic回归分析影响IgA肾病患者预后的危险因素

3 讨论

随着人们生活水平的不断提高及饮食习惯的改变，IgA肾病的发病率逐年增加，IgA肾病是一种发病率较高的原发性肾小球疾病，病理诊断特征是在肾脏系膜区沉积以IgA为主的免疫复合物[9]。临床上主要表现为肾间质纤维化、巨噬细胞/淋巴细胞浸润、肾小球硬化、急慢性肾炎、血尿、蛋白尿及肾功能衰竭等，另有部分患者会出现无症状血尿、蛋白尿，在临床上未能及时被发现，对患者生命健康造成严重威胁[10]。目前，临床多使用肾活检对IgA肾病进行诊断，虽然该方法是诊断IgA肾病的金标准，但在实际应用中，该方法一方面需要专业设备和技术人员的支持，另一方面在进行肾组织活体标本取样时会对患者造成损伤，在实际应用中存在诸多不足[11]。因此，寻找一种简单、快速的IgA肾病诊断方法，判断IgA肾病预后的指标对改善患者的生存状况有重要意义。

miRNA是一种由20～24个核苷酸组成的单链非编码RNA，广泛表达于真核生物中，参与调控细胞增殖、迁移、炎症反应、免疫平衡、信号转导等多种重要生物进程[12-13]。既往研究显示，miRNA与慢性肾病的发生发展密切相关，miRNA可引发和诱导足细胞凋亡、肾基底膜及肾小球发育异常、细胞外基质沉积、间质纤维化、系膜扩张、肾小球纤维化等，与糖尿病肾病、IgA肾病、肾癌等疾病密切相关[14-15]。miR-346是miRNA家族成员之一，动物实验发现，在糖尿病肾病小鼠模型中，miR-346可通过降低肾组织中SMAD3/4的表达，从而对糖尿病肾病小鼠的肾功能进行改善，减缓糖尿病肾病的进展[16]。SU等[17]研究发现，miR-346通过靶向N-myc下游调节基因2（N-myc downstream-regulated gene 2,NDRG2）可促进缺氧条件下肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭。以上研究提示，miR-346异常表达可能与肾损伤性疾病密切相关。本研究结果显示，IgA肾病患者血清miR-346水平低于对照组，且随着病情的进展，miR-346水平逐渐降低。提示miR-346可能在IgA肾病的发生发展过程中发挥重要作用，有利于评估IgA肾病患者病情。推测miR-346低表达可促进肾小管上皮细胞凋亡，同时促进了细胞炎症反应和氧化应激反应，促进肾组织和肾功能损伤[5]，进而影响IgA肾病的病理发展，但其作用机制需进一步探究。

分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）作为Wnt信号通路抑制剂，能够竞争性地阻断Wnt信号传递并与细胞膜上的卷曲蛋白受体结合，间接的对β-actenin水平和Wnt信号通路产生影响，目前在肿瘤领域被广泛研究[18]。SFRP-4是SFRP家族成员之一，位于染色体7p14.1上，SFRP-4是Wnt的拮抗剂，可通过结合Wnt受体和卷曲受体阻断其信号通路，并在多种疾病的发生发展过程中起着重要作用。研究发现，SFRP-4作为与炎症相关的因子，在恶性肿瘤[19]、糖尿病肾病[20]等多种疾病的发生中发挥作用。目前关于SFRP-4与IgA肾病之间的关系研究较少，本研究结果显示，IgA肾病患者血清SFRP-4水平高于对照组，可能是由于SFRP-4是一种Wnt信号拮抗剂，可激活Wnt信号通路，当IgA肾病患者出现肾功能异常时，Wnt4/β-actenin信号通路异常活化，进而需大量SFRP-4进行抑制，因此SFRP-4表达水平升高[21]。进一步相关性分析显示，IgA肾病患者病情程度与血清SFRP-4水平呈显著正相关，患者病情越严重，SFRP-4表达水平越高。IgA肾病血清SFRP-4水平升高，加速细胞外基质降解及纤维化进程，使T调节细胞分化，产生更多的炎症递质，从而使氧化自由基和活性氧生成增加，诱发氧化应激损伤，进而使肾组织损伤加重[20]。此外SFRP-4可引起血管收缩功能障碍，引发肾小球疾病，从而使肾功能降低，导致肾脏纤维化，使IgA肾病患者病情加重[22]。本研究进一步分析发现，102例IgA肾病患者中，30例进入预后不良组，且预后不良组患者血清miR-346水平相比预后良好组更低，SFRP-4则更高，多因素Logistic回归分析得出，SCr，24 h尿蛋白定量、eGFR，血清miR-346，SFRP-4是影响IgA肾病患者预后的独立影响因素，提示血清miR-346，SFRP-4的异常表达与IgA肾病患者预后不良有关，且SFRP-4，miR-346在IgA肾病的发生发展过程中发挥重要作用。

综上所述，血清miR-346在IgA肾病患者中表达水平较低，与病情程度呈显著负相关，血清SFRP-4在IgA肾病患者中表达水平升高，与病情程度呈显著正相关，两者可对IgA肾病患者病情进展进行有效监测。且两者均是影响IgA肾病患者预后不良的独立影响因素，可作为IgA肾病预后不良的重要指标。然而本研究仍存在以下不足：①随访时间相对较短，部分IgA肾病患者进展为ESRD时间较长，可能会对本研究造成偏倚；②样本量相对较少，未来将扩大样本量进行更深入的探究；③未深入探究SFRP-4，miR-346影响IgA肾病患者预后的具体途径，故评估价值仍需进一步研究。