人类嗜T 淋巴细胞病毒抗体血清学筛查与确证试验的相关性分析*

邓燕清 王淏 单振刚 谢君谋 杜荣松 肖巽南 李仲平 戎霞 黄伯泉

(广州血液中心 广州市血液安全重点实验室，广东 广州 510095)

人类嗜T 淋巴细胞病毒(human T - lymphotropic virus，HTLV)，是20 世纪70 年代末发现的第1 个人类逆转录病毒，有4 个亚型(HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ)[1]。 目前较有临床意义的是Ⅰ型和Ⅱ型(即HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ)，属逆转录病毒科的RNA 肿瘤病毒亚科[2]。HTLV-Ⅰ、Ⅱ的传播方式主要有输血(15%～60%)、注射或性接触，也可通过垂直传播(经胎盘、产道或哺乳)，国内有报道献血者家庭成员阳性感染的情况[3]。 HTLV 病毒通过感染CD4＋T 淋巴细胞引起T 细胞白血病、毛细胞白血病、HTLV 相关的脊髓病/热带痉挛性截瘫(HTLV-associated myelopathy /tropical spasticparaparesis)以及炎性疾病[4]，严重可引起死亡。 目前尚未发现治愈HTLV 感染的特效药物，也无相关疫苗，有报道称少部分药物可以缓解HTLV 感染相关疾病。HTLV 目前主要流行于日本的西南部、撒哈拉沙漠以南的非洲地区、加勒比海地区、南美洲等。 近年，国内的HTLV 流行区域主要集中在福建省、广东省、浙江省等东南沿海地区[5]。由于HTLV 可经输血传播，国家卫生健康相关部门于2015年颁发《关于做好人类嗜T 淋巴细胞病毒监测工作的通知》，要求部分采供血机构对无偿献血者开展HTLV 的筛查工作[6]。 目前，我国采供血机构对献血者的抗-HTLV-Ⅰ、Ⅱ的筛查均采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，本研究通过对广州地区无偿献血者抗-HTLVⅠ/ⅡELISA 检测反应性的标本进行免疫印迹法(Western blotting，WB)确证，采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 检测S/CO 值与WB 确证试验结果的相关性与阳性预测值，旨在更好地选择HTLV 监测方法提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2016 年7 月—2022 年8 月广州血液中心无偿献血者标本共2 223 225 份，EDTA-K2抗凝全血标本5 mL，2 000×g 离心5 min，血浆作血清学筛查，长期血浆保存于低温冰箱(-30℃以下)。 参与本次研究的献血者均签订了知情同意书，本次研究也获得广州血液中心伦理委员会的批准【广州血液中心医伦[2023]第033 号】。

1.2 试剂与仪器 抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 试剂(北京万泰公司，批号:T20160101—T20220202B)，HTLV BLOT 2.4(MPBiomedicals 公 司， 批 号: AK9013—AK1008 )。 Microlab STAR8CH 全 自 动 加 样 仪(HAMILTON 公 司)， Microlab FAME24/30 全自动酶免分析仪(HAMILTON 公司)，Multiskan MK3 酶标分析仪(Thermo Fisher 公司)、URANUS AE 288S 一体机(深圳爱康公司)。 所有试剂均在有效期内使用，仪器设备均按照要求操作，进行定期维护和校准。

1.3 方法 使用HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 试剂对献血者标本进行筛查，初筛检测呈反应性的标本进行单试剂双孔检测，双孔均为阴性者则为初筛试验阴性，双孔为阳性则为初筛反应性，记录各筛查试验的S /CO 值。 抗体初筛呈反应性的标本均采用WB 进行确证，结果阳性的判定为HTLV 阳性，结果阴性的判定为HTLV 阴性，结果不确定则为不确定性，同时对献血者进行随访。 检测抗-HTLV 试验过程严格按照其试剂说明书及广州血液中心实验的相关SOP 进行操作。

1.4 统计学分析 采用SPSS26.0 软件建立数据库，同时以WB 确证结果作为HTLV 感染阳性的确证标准，绘制ROC 曲线，利用ROC 曲线寻找S/CO 最佳诊断临界值；当Youden 指数(Youden 指数＝灵敏度＋特异度-1)最大时，其对应的S/CO 值为最佳阈值，用CI 表示95%的置信区间。 分析在最佳S/CO 阈值下试剂的灵敏度和特异度，计算其对确证试验结果的预测率，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 献血者标本抗-HTLV ELISA 检测与WB 确证结果2016 年7 月—2022 年8 月区间广州血站共筛查了献血者2 223 225人次。 共395 份献血者标本抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA检测反应性，初筛阳性率为18/10 万(395/2 223 225)。 395份初筛反应性标本经WB 确证有25 份为HTLV 阳性，不确定性为16 份，确诊阳性率为6.33%(25/395)。 广州地区献血者中HTLV 的感染率约为1.1/10 万(25/2 223 225)。

2.2 抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 检测的S/CO 值与确证试验结果相关性 绘制ROC 曲线分析:抗-HTLV ELISA 检测的S/CO值ROC 曲线下面积为0.938(P＜0.05)，Youden 指数为0.801，此时S/CO 值为3.789，灵敏度为92.00%，特异度为80.10%；95%CI:0.885～0.990，见如图1。 因此抗-HTLV ELISA 检测的S/CO 值≥3.789 时，对WB 确证试验的阳性预测率为35%，当S/CO 值＜3.789 时，其阴性预测率为99.4%，见表1。

图1 抗-HTLV ELISA 检测S/CO 值的ROC 曲线

表1 抗-HTLV ELASA 检测的S/CO 值与WB 确证结果的相关性n(%)

2.3 WB 确证结果阳性、阴性、不确定性与ELISA 检测S/CO值的对比 确证阳性标本S/CO 均值、中位数与确证阴性标本、不确定标本比较存在差异(P＜0.05)，见表2，提示标本ELISA 检测S/CO 值越高，WB 确证试验阳性率相对应越高。

表2 ELASA 检测反应性标本S/CO 值分布

3 讨论

HTLV 在全球范围均有发现，各地区流行情况差异较大[7]。 日本于1984 年开始对献血者进行筛查，其人群流行率高达0.66%～1.02%[8]。 其他发达国家如美国、法国，其感染率较低，分别为0.025 0%[9]、0.005 6%[10]。 我国HTLV 的流行区域主要集中在东南沿海城市，王惠榕等[11]、张秋文等[12]对我国福建宁德地区HTLV 感染情况作了早期报道。HTLV 流行情况调查主要是通过对献血人群进行筛查，加拿大、美国、韩国、法国，以及中国香港特别行政区、中国澳门特别行政区、中国台湾地区等已将HTLV-Ⅰ筛查列入献血者常规筛查项目[7]。 目前我国大陆地区并未将HTLV 纳入献血者的法定常规筛查项目，仅于2015 年底提出对福建、广东、浙江3 省献血者进行全面筛查，其他各省、市按照10%比例进行献血者抽样筛查。

目前我国常见的HTLV 检测方法主要为血清学与核酸检测，血清学检测方法以双抗原夹心ELISA 为主，按方法学分有一步法和两步法，确证方法则主要为WB 确证试验。 对于无偿献血者这类低危感染人群，由于被检者体内存在与被检测病原体无关的非特异性抗原抗体，往往会造成WB 确证结果不确定。 国外研究表明，出现“不确定”确证结果的受检者在半年内随访中一般转为阴性，或继续保持不确定性，即为假阳性，故在阴性预测值计算中，把不确定结果等同于阴性[13]。 在本研究中确证阳性率为6.32%(25/395)，与同属于低流行区域的广东省深圳市(6.06%，2/33)[14]、广东省中山市(3.2%，4/125)[15]、北京市(7.7%，2/26)[16]、天津市(5.3%，1/19)[17]差异不大，低于高流行区域福建省(26.8%，254/947)[18]。 本研究采用ELISA 法(一步法)对献血者标本进行筛查，非特异性抗体可引起假阳性反应率较高[19]，这与文献报道ELISA 试剂的S/CO 值与阳性率呈正相关[20-21]相符。 有文献报道2 种梅毒筛查ELISA 检测对应的S/CO 值分别≥9 以及≥5 时，梅毒确认阳性率超过95%[20]；抗-HCV ELISA 检测S/CO 值＞3.8 时，阳性预测率达95%以上[21]。 我们通过对献血者抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 检测反应性结果S/CO 值进行比对，同时绘制ROC 曲线分析抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 检测S/CO 值与WB 确证试验结果的相关性，综合考虑阳性预测率和阴性预测率，选用Youden 指数最大所对应的S/CO 值作为报告确证阳性的参考阈值，得出ELISA 检测最佳S/CO 值为3.789。 S/CO 值＜3.789 时其阴性预测率为99.4%，当S/CO 值为≥10 其确证阳性预测率可达71.4%。验证结果阳性的S/CO 值与阴性的S/CO 值比较有差异(P＜0.05)，此结果与欧山海[22]结论一致。 在确证阳性的标本中，有2 份ELISA 反应性标本S/CO 值＜3.789，献血者很可能为初期感染，HTLV 病毒载量较低，抗体滴度较低。 ELISA 法存在检测结果假阳性的问题很难避免，用WB 进行确证就很有必要。 欧山海等[18]研究指出，HTLV 初筛同一试剂假阳性率跟当地流行率有关系，同一试剂在流行率较高的地区如宁德市，抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 检测S/CO 值＞4 或5 时，其初筛试验的验证阳性率高达90%，而在HTLV 流行率较低的漳州市，其S/CO 值＞4 时验证阳性率为33.3%，S/CO 值＞5 时验证阳性率则为57.1%。 本地区2016—2022 年确诊阳性率为1.1/10 万，低于福建省宁德市的184.4/10 万，福建省漳州市的3.7/10 万，属于低流行区域，初筛假阳性率高[18]。 周晓真等[19]的研究指出，使用2 种抗-HTLV ELISA 试剂(北京万泰、意大利索尼)检测出的双试剂反应性标本，HTLV 确证试验均为阳性。 由于WB 确认试剂昂贵，供应有限，操作复杂，很难普及使用。 因此，我们认为对于初筛反应性标本，可用另一厂家的ELISA 试剂进行复核，对于单试剂检测S/CO 值＜3.789 可认为其为假阳性，对双试剂检测反应性标本或S/CO 值＞3.789 进行确证试验。 确证试验结果为“不确定”的16 名献血者中仅有1 名进行归队复查，结果为阴性；本课题组将继续对余下15 名“不确定”的献血者追踪随访。

综上所述，S/CO 值的诊断阈值能为我们提供一个预估参考指标，对可疑ELISA 结果可以作一个初步判断。 广州地区献血人群HTLV 流行率较低；抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 试剂检测假阳性率较高，确证试验很有必要。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。