随机质控加样方法在献血者血液ELISA 法检测中的应用与评价

冯友江 俞凯敏(镇江市中心血站 丹阳分站，江苏 丹阳 212300)

酶联免疫吸附试验(ELISA)因其较高的灵敏度和特异性，一直是我国采供血机构筛查献血者血液的重要检测技术和方法，对于保障临床用血的质量和安全起到了至关重要的作用。 目前我国采供血机构对献血者的血液筛查已基本实现了全自动化，象ELISA 法检测主要采用全自动加样仪和全自动酶免分析仪，在检测过程中为方便操作和观察结果，采供血机构检验(科)人员通常多会采用酶标板固定孔位来做外部质控——在每块酶标板第1 竖排(A1—H1)固定孔位设置空白、阴性、阳性对照孔与外部阴性、阳性、质控孔——但其存在的加样时间差多少对检测结果造成影响[1-2]，也难以做到对酶标板每个孔位的有效监测，更难以发现影响检测结果的边缘效应[3]，可能室内质控显示在控，但实际结果已有偏差，特别是处于临界值附近的结果可能是假阳性或假阴性。 为此，近年来国家在推进医学实验室质量和能力认可时，明确要求免疫学检验的质控物的位置不能固定，而要随机放置且应覆盖所有酶标板检测孔位，以便更好地监测试验的有效性[4-6]。 按此要求，本站对酶标板固定孔位质控与随机质控的加样方法作了比较和分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 质控数据来源 从本站安全输血标准化系统(Spring 2016，广东穿越医疗科技有限公司)和实验室质量管理与控制系统(Liswell5.29，烟台海深威软件有限公司)提取本站2022 年5 月—2022 年7 月2 610 名无偿献血者血液传染性指标(HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP)的ELIEA 筛查结果记录，献血者年龄18—59(39.6±10.4)岁，男性1 775 名、女性835 名，献血前健康检查均达到相应的国家标准[7]；其中初次献血者1 017 名、重复(献血次数≥2 次)献血者1 593 名。

1.2 试剂与仪器 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 2 次检测试剂，包括HBsAg 试剂(上海科华和厦门英科新创产品)，抗-HCV 试剂、抗-HIV 试剂和抗-TP 试剂(北京万泰和英科新创产品)，本次研究主要以ELISA 二检(试剂)的质控为对象，所用试剂为HBsAg(批号2021125137)、抗-HCV(批号2021125827)、抗-HIV(批号2021126628)和抗-TP(批号2021127536)(厦门英科新创产品)；4 项血液筛查指标J 标准物质(批号202011024，北京康彻思坦生物技术有限公司)。全自动加样仪(8-CH STAR)、全自动酶免分析仪(FAME24/20)(瑞士HAMILTON 公司)；实验室质量管理与控制系统(Liswell 5.29，烟台海深威软件有限公司)。

1.3 输血传染性指标ELISA 复检的随机质控 在ELISA 酶标板满板操作时，采用全自动加样仪常规加样与设置随机质控孔:将4 项传染性指标的J 标准物质作为“日常标本”(3.0 mL/支)，分别加入HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP 酶标板A1 孔、H12 孔及随机孔位(加样量分别为100、10、50、100 μL)[同时由生产厂家的设备工程师在加样系统后台以HSL方法编辑器编程，建立a×s 的数学模型(a 为O＃1 之间任意随机数，s 为1＃m 之间批检测标本数)]，设计不固定位置的质控[8]。 加样结束后，酶标板上全自动酶免分析仪检测:以随机孔位质控值作为室内质控判定标准，每个项目均连续检测20 次(d)(1 次/d)，再按孔位不同分为A1、H12 组和随机3 个组[检测结果20(次)个/组]，利用实验室质量管理与控制系统(Levey-Jennings 质控图法[9])绘制出随机孔位的室内质控(框架)图，将各个检测项酶标板相对应的A1 组、H12 组结果绘制入质控图中做比较分析。

1.4 随机质控限的设定与判定规则 质控结果(数据)[标本吸光度(S)/临界值(CO)]以“均数±标准差(¯x±s)”表示，质控限以“s倍数”表示，当质控结果在¯x±2s之间为“在控”，在¯x±(2—3s)内(1—2s)判定为“告警”，在¯x±3s之外(1—3s)、或2 个(次)连续质控结果均在¯x±2s(2—2s)之外、或7个(次)连续质控结果落在¯x的同一侧(7¯x)、或7 个连续的质控结果呈现出向上或向下趋势(7T)均为“失控”。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计软件包(美国IBM)做统计学分析，计数资料[变异系数(CV)]用“百分率(%)”表示，组间比较采用卡方检验；计量资料(S/CO值)用“¯x±s”表示，2 组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，采用LSD-t检验做组间两两比较；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随机质控法应用于血站血液传染性指标复检 献血者输血传染性指标ELISA 法复检随机质控(法)水平(S/CO)均值:A1 组＞随机组＞H12 组，与3 个组加权平均值比较，只有随机组每项指标均无明显差异(P＞0.05)；与随机组比较，A1组每项的平均值明显升高(P＜0.05)、H12 组每项的平均值偏低(P＜0.05)，CV值皆差异甚微(P＞0.05)(表1)。

表1 随机质控法应用于输血传染性指标ELISA 复检效果 (S/CO)

2.2 血站血液传染性指标复检的随机(法)质控图 采用实验室质量管理与控制系统绘制出ELISA 法复检酶标板随机组结果的室内质控(框架)图，将各个检测项酶标板相对应的A1、H12 组质控结果绘制入图:随机法HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 复检质控图[20 个(次)检测(点)]中，出现了6 个点(HBsAg 3 次、抗-HCV 1 次、抗-HIV 2 次)位于¯x±(2s～3s)之间，这当中除H12 组只有1 个位点于¯x－2s外(图1-A)，A1 位组有5 个点位于¯x＋2s外(图1-A，B，C)。

图1 输血传染性指标(HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和TP)ELISA 复检随机(孔)法室内质控图

3 讨论

近年来，随着与无偿献血及血站建设法制化的推进和落实，以及国家对血站财政投入的增加，血液检测的新技术、新设备已快速地在血站中应用，血液检测已迈上了自动化、信息化、标准化正轨，使得临床供(用)血的质量安全得到了有效的保障。 这特别体现在目前我国血站常用ELISA 法对献血者血液传染性指标的检测基本实现了从加样到过程处理、结果分析全自动化，部分发达地区的血站甚至采用了全自动流水线检测，不但检测结果准确、检测时间缩短，而且检测结果报告的发放更加及时，有效提升了临床供血的保障水平。

ELISA 法检测方式的进步势必也要有与之匹配的质控方法，如虽然加样采用了全自动加样仪操作，但是在给整块酶标板满板加样时，加样时间一般会在12—15 min，也就意味着第1 个和最后1 个标本加入时差≥12 min[2]，需要有合适的质控方法。 本组实验数据显示，献血者HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 法复检采用随机法质控水平(S/CO)均值比较，3 个组为A1 组＞随机组＞H12 组(P＜0.05)(表1)，足见ELISA 法酶标板第1 排孔与最末排孔加样时差(≥12 min)对病原体抗原抗体反应(ELISA 法检测结果)的影响:检测时A1 孔中的标本反应时间比H12 孔中的标本起码多12 min，所以检测(质控)水平相对较高。 随机质控组质控水平与3 组加权平均值相近(P＞0.05)，是由于随机组的质控加样[在酶标板(孔)中随机加样]的时差介于A1—H12孔，平均加样时间约为1 块酶标板整板加样时间的一半——有研究显示控制ELISA 法检测加样时差＜10 min，对其检测结果的影响甚小(P＞0.05)[2]——因此随机质控不但能够保证检测水平，而且可有效减少人为设置固定孔位质控引起的系统误差；另外，还可以发现可能存在的边缘效应对ELISA检测结果的影响，从而保障血液检测结果的可靠性[2-5]。

在我们采用随机质控法[以随机质控为框架(标准)]制定的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 和抗-TP ELISA 复检质控图中，连续检测酶标板A1 孔(组)，有5 个点(5 次检测)¯x＋2s外，H12 孔(组)有1 个点(1 次检测)位于¯x－2s外，亦即该质控图发生过6 次“告警”(图1)。 设想如果我们始终将质控物设置在酶标板第1 排的固定孔位，其结果势必会对整板检测结果的判断造成一定的影响，特别是对于判断处在临界值附近的低浓度传染性性标志物标本的结果判断存在一定难度(也就多了一分风险)——这也正是我们将A1 和H12 孔设为研究对象的初衷。 虽然影响ELISA 法检测室内质控的原因除与酶标板固定质控孔位设置相关外，还与人员试验操作、设备参数设定、试剂贮存及其室温平衡、实验室温湿度、质控品反复冻融与混匀等多方面因素有关[10-20]，除了血站检验(科)人员在检测时必须严格按照试剂与仪器说明书操作，做好日常的设备维护保养，设备定期校验，定期核查设备参数与试剂说明书的一致性外，还要建立合适的质控方法，对整个实验进行质量控制，确保检测结果的可靠性和稳定性。

综上，随机(加样)质控法应用在血站ELISA 法血液筛查中是科学和合理的，首先可有效减少因人为设置固定孔位质控引起的系统误差，其次便于发现ELISA 酶标板外周孔可能存在边缘效应对检测结果的影响。 血站为确保和加强献血者血液筛查的质量和能力，其检验(科)人员在用ELISA法做相关检测时，应对“人、机、料、法、环、信”等每一环节做严格的室内质控，才能保证检测结果的准确性、及时性和有效性。 需特别说明的是，由于不同厂家全自动加样仪加样程序的系统平台和设计理念不同，对于随机质控位的自动化算法还需厂家工程师的配合和编程，本随机(加样)质控法目前仅在HAMILTON 公司STAR 全自动加样仪中加以实现，对于其他厂家的全自动加样仪还有待今后的进一步研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。