用酶联免疫试剂盒检测鸡肉中的金刚烷胺
2018-02-14樊秀敏
樊秀敏
(辽宁省朝阳市建平县畜产品安全监察所,辽宁 朝阳 122400)
金刚烷胺为禁止用于兽用的抗病毒药品。金刚烷胺具有神经毒性,能使中枢神经系统受刺激或中毒,在食品中残留,对心肺及肾功能不全者,还容易导致蓄积毒性。
1 酶联免疫试剂盒准备
金刚烷胺酶联免疫试剂盒(Ⅳ型)。北京维德维康生物技术有限公司生产。
2 原理
鸡肉中的金刚烷胺与酶标板上固定的金刚烷胺特异性竞争抗体,当鸡肉中不含金刚烷胺或金刚烷胺含量很少时,更多的抗体就会与酶标板上的金刚烷胺结合,结合物被固定在酶标板上,加入酶标记物以后,底物被催化显色,根据显色的深浅来判断鸡肉中金刚烷胺的含量。显色越深,含量越少,显色越浅,含量越多。
3 工作液准备
3.1 样品提取液 1份浓缩样品提取液加19份去离子水。
3.2 样品稀释液 1份浓缩样品稀释液加9份去离子水。
3.3 洗涤工作液 1份浓缩洗涤液加19份去离子水。
3.4 酶标记物工作液 1份酶标记物浓缩液加10份酶标记物稀释液。
4 鸡肉前处理
4.1 称取2±0.05g均质后的鸡肉于50mL离心管中。
4.2 加入4mL样品提取液充分涡动5min。
4.3 离心机4000g以上,离心5min。
4.4 取0.2mL上清液于干净离心管中,加入0.2mL样品稀释液充分涡动10s。
4.5 取50μL进行检测。
5 检测
5.1 根据样品数量的多少取出相应数量的酶标板条固定在酶标板架上,要求做两个平行样,标记清楚标准品和样品的滴加位置。未使用的酶标板条用自封袋密封后,立即保存期于2~8℃环境中。
5.2 将 50μL 各标准品工作液(0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb)和50μL各样品溶液分别加入对应的酶标板孔中。
5.3 各孔均加入50μL酶标记物工作液,枪头不能接触到酶标板孔中的液体。
5.4 把酶标板用盖板膜盖好,轻轻振荡酶标板10s,使溶液充分混匀,在室温(25±2℃)下避光反应30min。
5.5 揭开盖板膜,把酶标板孔中的液体倒净,在每个孔中分别加入260μL洗涤工作液,充分洗涤4次,每次浸泡10~20s。
5.6 洗涤完毕后,倒掉酶标板孔中洗涤工作液,将酶标板倒倒置于吸水纸上,轻轻拍打到拍干。(用干净的枪头戳破孔底的气泡,为防止交叉污染戳气泡时要更换枪头)
5.7 立即在每个孔中分别加入100μL底物A、B的混合液(底物A、B按1:1比例混合,混合液使用不能超过5min)。
5.8 把酶标板用盖板膜盖好,轻轻振荡酶标板10s,使溶液充分混匀,在室温(25±2℃)下避光反应10min。
5.9 揭开盖板膜,各孔中分别加入50μL终止液,轻轻振荡酶标板10s,使溶液充分混匀。
5.1 0 加入终止液5min内,用酶标仪在双波长450nm、630 nm下读取酶标板吸光度值。
6 注意事项
6.1 试剂盒贮存于2~8℃环境中,切勿冷冻。
6.2 使用试剂盒前,应仔细阅读说明书。
6.3 请勿使用过期试剂盒,不同批号试剂盒中的试剂不能混用。
6.4 使用试剂盒前,将盒内各组份放在实验台上恢复至室温25±2℃。
6.5 样品处理前先恢复至室温,处理完毕后应立即检测。
6.6 避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。
6.7 各试剂在使用前应摇匀,混合时避免出现气泡。
6.8 酶标板孔中加入样品溶液、酶标记物工作液、AB混合液、终止液各步骤时间不得超过3min。
6.9 终止液中含有强酸物质,若不小心溅到皮肤或衣物上请立即用水冲洗。
6.1 0 检测过程中所用枪头不得重复使用。
做酶联免疫检测实验是一项认真谨慎的工作,把握好每一个环节都显得尤为重要,只有严格按照操作要求去做,才能保证检测结果的准确性,同时对监控违禁药品的使用也具有重要意义。