Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃癌细胞增殖的影响

陈健，李利义，诸葛林敏，马香爱，朱岳升，俞耀军

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.胃肠外科；2.手术室；3.消化内科

胃癌是恶性肿瘤死亡的第四大原因，尽管目前临床上进行的化疗、放疗、手术治疗以及一些分子靶向治疗能够显著延长胃癌患者的生存期，但其5年生存率依然很低[1]，因此，进一步研究胃癌发生的分子机制，寻找胃癌患者新的治疗靶点并采取针对性的治疗策略具有重要的意义[2]。复制蛋白A1 （replication protein A1, RPA1）是三聚体复制蛋白A的最大亚基，在真核细胞DNA复制、同源重组和切除修复中起核心作用，其在食管癌、结肠癌、尿路上皮癌等多种癌症中均被扩增[3-5]。有研究发现，RPA1在胃癌中呈现高表达，与患者的临床特征、预后之间存在相关性[6]，但是，具体机制尚不清楚。微小RNA（microRNA, miRNA）是一类小分子非编码单链RNA，在转录后水平抑制靶mRNA的翻译或降解mRNA， 参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等。研究显示，miR-30a在胃癌和卵巢癌细胞中通过靶向调控RPA1基因的表达进而抑制细胞增殖[7]，但miRNA与RPA1在胃癌中的相互作用尚不明确，因此，本研究在胃癌细胞中通过RNA pulldown技术探究了RPA1结合的miRNA，结果发现miR-145在胃癌细胞中靶向结合并调控RPA1基因的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂 胃癌SGC-7901细胞（中科院细胞库），FBS、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胰蛋白酶、脂质体2000、TRIzol试剂（美国 Invitrogen公司），miRNA分离试剂盒（美国Ambion公司），All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒（美国Gene Copoeia公司），has-miR-145模拟物、miRNA对照物（上海吉玛制药技术有限公司），生物素标记的RNA pulldown探针（生工生物工程（上海）股份有限公司），RNA pulldown试剂盒（上海泽恒生物科技有限公司），RPA1抗体（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗（美国CST公司），双荧光素酶活性检测试剂盒（美国Promega公司），包含RPA1基因3’-非翻译区（3’UTR）荧光素酶报告载体由上海吉凯基因公司包装合成。

1.2 RNA pulldown回收实验 使用RNA pulldown试剂盒进行RNA回收实验，参照文献[8]并做稍加修改。使用的探针列于表1。将对数生长期的SGC-7901细胞接种于培养皿中，待细胞生长密度达80%时分为两组，即RPA1探针回收组和对照探针回收组。首先用甲醛对细胞进行交联，加甘氨酸缓冲液进行平衡，加裂解液收集细胞。细胞样品经超声处理后离心。上清液移入2 mL离心管中。细胞裂解液用生物素标记的RPA1探针或对照探针旋转孵育3 h。然后再加入链霉亲和素磁珠旋转孵育1 h。清洗磁珠3次。随后进行解交联处理，然后加TRIzol纯化RNA。使用All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒，检测纯化的miRNA。

表1 RNA pulldown探针

1.3 细胞增殖能力检测 SGC-7901细胞增殖活性检测采用MTT法。细胞在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2的培养箱中培养。共分为3组：空白对照组（PBS组）、对照miRNA组（转染miRNA对照模拟物）和miR-145组（转染has-miR-145模拟物）。取各组转染后的细胞，以2.5×104/mL的浓度，每孔200 μL接种于96孔板中，每组设3个复孔。分别培养24、48、72 h后，加入5 g/L的MTT溶液 20 μL。继续孵育4 h后，弃去上清液。然后每孔加入150 μL的二甲基亚砜，充分振荡溶解结晶紫，混匀后用酶标仪于490 nm处测定OD值。实验重复3次。

1.4 细胞周期检测 按上述1.3分组和准备细胞，用胰蛋白酶消化各组细胞，吹打使其充分变匀，制备成单细胞悬液离心，收集到流式专用管中，离心并去上清液，PBS液进行重悬，移入离心管内，加入无水乙醇，在-20 ℃温度固定24 h以上；细胞固定好以后，离心，去掉上清液，使用PBS洗涤沉淀若干次，用l mg/mL的RNase A溶液消化细胞内的RNA；用PI溶液避光环境下染核10 min；最后用流式细胞仪分析3组细胞细胞周期百分比。

1.5 Western blot法检测RPA1蛋白的表达 按上述1.3分组和准备细胞，收集各组细胞，PBS冲洗后，加入裂解液冰上裂解30 min，超声破碎细胞，低温离心后取上清液加样，经电泳蛋白分离和转膜，50 g/L 脱脂奶粉封闭30 min。用RPA1（1:1 000稀释）一抗孵育，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加兔抗鼠二抗常温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。 凝胶成像系统显色曝光，Quantity One进行灰度测量分析。

1.6 双荧光素酶报告基因检测 PCR扩增RPA1基因3’UTR，构建包含RPA1 3’UTR的质粒（pMIR-RPA1）和不包含RPA1 3’UTR的对照质粒（pMIR）。调整胃癌SGC-7901细胞浓度为2.5×105个/mL，每孔2 mL接种于6孔板中。待细胞融合至60%时，分别共转染pMIRRPA1与miR-145模拟物或miRNA对照模拟物、pMIR与miR-145模拟物或miRNA对照模拟物。转染12 h 后，更换培养基，继续培养24 h，收集细胞。参照试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

1.7 生物信息学分析 收集TCGA数据库375例胃癌组织及32例正常胃黏膜组织的RNA测序数据，比较两种组织中RPA1基因表达量[log2（TPM+1）]的差别。生存分析由在线分析工具Kaplan-Meier plotter （http://kmplot.com/analysis/）完成。

1.8 统计学处理方法 采用GraphPad Prism 6统计软件进行分析。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPA1基因在胃癌组织中显著高表达 生物信息学分析结果显示，相比较于正常胃黏膜组织（n= 32），肿瘤组织（n=375）中RPA1基因的表达量显著升高（P＜0.05），见图1。

2.2 RPA1基因在胃癌组织中高表达与患者较差的预后相关 根据胃癌组织中RPA1基因表达量的高低对TCGA数据库中的胃癌患者进行了分组，并比较了其生存情况，结果显示，RPA1基因高表达组（n=459）的预后显著差于低表达组（n=172），HR=1.72（1.32～2.25，P＜0.01）。见图2。

图2 RPA1基因表达与胃癌患者预后的相关性

2.3 miR-145靶向结合RPA1基因3’UTR区 为了明确胃癌细胞中结合RPA1基因的miRNA，本研究设计了靶向RPA1基因3’UTR区的探针，进行了RNA pulldown 回收，并对回收到的miRNA进行了qRT-PCR检测，结果发现，miR-145在胃癌细胞中和RPA1基因3’UTR区结合最高（见图3）。

图3 采用RNA pulldown法在胃癌细胞中回收并分析靶向结合RPA1基因3’UTR区的miRNA

2.4 miR-145在胃癌细胞中抑制RPA1基因的表达 为了验证miR-145在胃癌细胞中是否能调控RPA1基因的表达，本研究进行了荧光素酶报告基因检测和Western blot检测。荧光素酶相对活性分析结果显示，miR-145组相比于对照miRNA组显著降低（P＜0.05，见图4A、图4B）。Western blot检测结果显示，与转染对照miRNA组比较，miR-145组RPA1表达显著下降（P＜0.05，见图4C、图4D）。

图4 胃癌细胞中检测miR-145对RPA1基因的靶向和调控作用

2.5 miR-145抑制胃癌细胞增殖 MTT实验结果表明，胃癌细胞转入miR-145后72 h，细胞增殖显著降低（P＜0.05），见图5。

图5 MTT检测miR-145对胃癌细胞增殖的影响

2.6 miR-145阻滞胃癌细胞周期 流式细胞术结果显示，胃癌细胞转染miR-145后，细胞阻滞在G2/M期（P＜0.05），见图6。

图6 流式细胞术检测miR-145对胃癌细胞细胞周期的影响

3 讨论

胃癌是消化道常见恶性肿瘤，全球每年约有85万新增胃癌病例，65 万例死亡病例[9]。尽管进行了大量的临床和基础研究，但人们对它仍然知之甚少。致癌基因蛋白表达、幽门螺杆菌感染、饮食因素、吸烟、饮酒、肥胖等因素均与胃癌的发生发展相关[10-11]。尽管在早期发现、治疗和预防方面取得了进步，但晚期胃癌仍然是不可治愈的，其5年生存率仅为4%～5%[12]。

无限制的癌细胞增殖是肿瘤发生的原因[13]。为了找到治疗癌症的方法，人们已经在努力寻找抑制恶性细胞增殖的方法。有丝分裂是真核细胞增殖的主要途径，在这个过程中，DNA被复制，然后将细胞的遗传物质传递到下一代细胞中。任何DNA复制的缺陷或DNA损伤都会触发一个检查点，延迟细胞周期的进程，并促进DNA修复。如果错误无法恢复，细胞将启动死亡程序以消除危害[14]。RPA1基因在DNA复制中起关键作用。它帮助解开双链DNA，招募聚合酶将核苷三磷酸结合到新合成的DNA链中，并保持基因组的完整性[15-16]。RPA1缺陷会引起自发的DNA损伤，诱导DNA复制检查点，从而抑制有丝分裂或启动细胞死亡[15，17]。研究发现RPA1基因与肿瘤的发生发展密切相关。RPA1可以通过CDK4/Cyclin-D 通路促进肝细胞癌增殖[19]。沉默RPA1可增强结直肠恶性肿瘤细胞对5-Fu的敏感性[19]。RPA1表达的下调可通过阻断RAD51的DNA损伤位点增强鼻咽癌的放疗敏感性[20]。本研究发现，与正常胃黏膜比较，胃癌组织中RPA1基因的表达显著上调，且RPA1的高表达与患者较低的累积生存率相关，提示RPA1在胃癌的发生发展过程中起着重要的作用，因此，RPA1可能可以成为胃癌治疗的潜在靶点。已有研究表明RPA1可通过各种转录后修饰如泛素化、巴豆酰化调节其功能[21-22]。然而，目前对于RPA1的表达调控的研究却鲜有报道。研究显示，miR-30a在胃癌和卵巢癌细胞中通过靶向调控RPA1基因的表达进而抑制细胞增殖[7]，但是否还有其他miRNA在胃癌细胞中参与RPA1基因的表达调控还不清楚。

miRNA是一种长度约为22 nt的单链小RNA，进化高度保守，可参与细胞生长、分化、凋亡和血管生成等多种重要的生物学过程。有研究发现，miRNA 可以通过与靶mRNA的3’-UTR结合而影响靶基因mRNA的转录后翻译[23]。本研究采用RNA pulldown技术全面分析了靶向RPA1基因3’-UTR的miRNA，结果发现多种miRNA包括miR-30a结合RPA1基因3’-UTR区域，但miR-30a并不是结合最多的miRNA，miR-145在RPA1基因3’-UTR区结合最高。

miR-145是一种抑癌miRNA，可通过对多种靶基因的调控抑制肠癌、食管癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，参与肿瘤的发生发展调控[24-25]。XU等[26]发现miR-145通过靶向（mTOR）/p70S6K1信号通路抑制结肠癌患者肿瘤细胞生长和血管生成。WANG等[27]发现miR-145通过靶向AEG-I/MTDH信号通路抑制非小细胞肺癌患者肿瘤细胞侵袭和转移。也有研究发现，miR-145在胃癌肿瘤组织内的表达明显下调[22]，miR-145通过靶向IRS-I/β-actin信号通路抑制胃癌细胞的增殖[28]，通过靶向Six1 基因抑制胃癌细胞侵袭、血管形成及上皮间质转化[29]。本研究结果显示，在胃癌细胞中miR-145可以抑制RPA1基因的表达，且将miR-145转入胃癌细胞会通过抑制RPA1基因的表达抑制细胞的增殖，miR-145对胃癌细胞增殖的抑制是通过阻滞细胞周期获得的。

综上所述，本研究发现miR-145可以通过靶向下调RPA1的表达而阻滞胃癌细胞周期并抑制细胞增殖，这可能为胃癌的治疗提供一个新靶点。但是，本研究仅用了SGC-7901细胞，未来尚需在不同的胃癌细胞系进行实验验证，并进一步探讨miR-145在RPA1基因3’UTR区的具体结合位点。