中线蛋白2在胃癌中表达上调并促进胃癌细胞恶性表型

陈谢滔，胡贤静，邱天乐，沈贤，薛向阳

1.温州医科大学 微生物与免疫学教研室 分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院 麻醉科，浙江 温州 325027；3.温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015

胃癌（gastric cancer, GC）是世界上第五大常见的癌症和第四大癌症相关死亡原因[1]。近年来，尽管在外科手术和化疗方面取得了一些进展，但GC患者的五年生存率仍不足10%，这主要是由于大部分的胃癌患者被发现时已经处于进展期，导致其对术后化疗或者新型免疫疗法的响应率和获益率并不理想[2-4]。因此，寻找GC诊断的新生物标志物或新型治疗靶点，并进一步探究GC恶性进展的分子机制，对于改善患者的预后是非常重要的。

中线蛋白2（midline 2, MID2）也称为三方基序蛋白1（tripartite motif-containing protein 1, TRIM1），属于TRIM蛋白家族成员[5]。TRIM家族有超过70个成员，被报道参与多种细胞过程和信号通路，其大多数成员都具有E3泛素连接酶活性。现有的研究结果表明，MID2参与激活NF-κB/AP-1信号通路，这提示我们该蛋白可能在肿瘤进展中发挥重要作用[6]；MID2在乳腺癌细胞中高表达，能促进乳腺癌细胞的增殖和致瘤性，可能是乳腺癌的一个有价值的治疗靶点[7]。但关于MID2在胃癌细胞中的表达情况及作用研究鲜有报道。本研究通过温州医科大学附属第一医院的胃癌临床样本及公共数据库综合评估了MID2在胃癌中的表达特点和预后影响，通过细胞实验评估了MID2在胃癌细胞中的生物学效应，旨在对胃癌潜在治疗靶点的发现做出一定贡献。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人胃癌细胞BGC-823和SGC-7901均购自中国科学院细胞库。用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱。

1.1.2 试剂：胎牛血清、DMEM培养基购自美国 Gibco公司；MID2兔多克隆抗体购自美国Thermo Fisher Scientific公司；GAPDH兔多克隆抗体购自美国Proteintech公司；兔二抗购自美国Proteintech 公司；Western blot配置试剂盒及细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司；Transwell小室购自美国康宁公司；基质胶购自美国BD生物科技有限公司；MID2质粒构建序列为前向引物：CCCAAGCTTGCCACCATGGGTGA AAGCCCAGCC；后向引物：CCGGAATTCCTATTAAGCGTAG TCTGGGACGTCGTATGGGTAATGACAGGTTTTCATCCCA，引物购于北京六合华大基因科技有限公司；质粒构建所需切胶回收、纯化、大提试剂盒均购自美国Omega Bio-tek公司。靶向MID2的小干扰RNA（siRNA）序列为GCGCAACAGCGAACTAGAA（5’-3’），委托广州锐博生物科技有限公司进行合成。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：用于组织芯片分析的胃癌标本收集自2014年1月至2016年12月于温州医科大学附属第一医院行胃癌根治性切除手术的患者，包括420例胃癌组织和41例对应的癌旁正常组织（距肿瘤切缘至少10 cm）。剔除脱片的组织后，对组织染色情况进行分析，计算阳性区域光密度值/肿瘤总面积光密度值，得到MID2-Score评分。本研究获温州医科大学附属第一医院伦理审查委员会的批准（批号：2019046）。

1.2.2 生物信息学分析：使用R的TCGAbiolinks包下载TCGA数据库中胃腺癌患者的基因表达数据和临床数据。根据ROC曲线最大约登指数确定MID2表达量预测生存的最佳分组截断值。R的survival（3.3.1），survminer，ggplot2（3.3.6）包被用于进行生存分析。

1.2.3 免疫组化：将组织芯片放入65 ℃烘箱中2 h 脱蜡；梯度乙醇浸泡后附水；抗原修复后用免疫组化笔圈出组织边缘，5%的山羊血清封闭30 min；封闭完成后滴加MID2多克隆抗体室温下孵育2 h；二抗孵育30 min；DAB显色液（50×）孵育10 min；苏木素染色，过盐酸乙醇分化；PBS溶液反蓝后梯度乙醇脱水；二甲苯浸泡5 min后中性树脂封片保存。使用数字切片系统对组织芯片进行全视野扫描，使用CaseViewer软件对扫描的芯片进行观察；采用Image-ProPlus软件对抗体染色强度进行量化并分析。

1.2.4 MID2 质粒构建：从NCBI官网检索并下载MID2基因的蛋白质编码序列，设计带有特异性内切酶位点的前后向引物；使用高保真酶以胃癌细胞BGC-823的cDNA为模板，扩增目的基因片段；核酸胶电泳分离目的条带后使用切胶回收试剂盒回收PCR产物；使用特异性内切酶将PCR产物和pcDNA3.1野生型质粒同时进行双酶切；酶切产物纯化分离后使用T4连接酶进行酶连。酶连条件：16 ℃反应 16 h；使用DH5α感受态细胞进行酶连产物转化并涂板；挑取单克隆菌置于含AMP的LB培养液中，37 ℃恒温摇床扩增菌液；吸取单克隆菌液送DNA测序；序列验证成功后将菌液扩大培养，使用大提试剂盒进行质粒提取，得到pcDNA3.1-MID2-HA重组质粒，测定质粒浓度。

1.2.5 Western blot实验：将胃癌细胞铺板于6孔板中，转染质粒或si-RNA，培养箱中培养48 h；使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白；配置浓度为10%的SDS-PAGE凝胶；电泳分离蛋白样（电泳条件：80 V 30 min；120 V 60 min）；电泳完成后于冰水浴中将蛋白转印至PVDF膜（转膜条件80 V 90 min）；转膜结束后将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中，室温下摇床封闭40 min；加入1:1 000稀释的MID2兔多克隆抗体，于4 ℃摇床上孵育过夜；兔二抗室温下摇床孵育2 h，最后TBST洗膜并使用ECL发光试剂进行显色并曝光。

1.2.6 CCK-8细胞增殖实验：将胃癌细胞以合适密度接种于96孔板（4 000～5 000个/孔），待细胞完全贴壁后按照lip2000 转染说明书转染质粒或si-RNA，转染8 h后换液；分别于转染后24、48、72、96 h吸弃培养基，每孔加入100 μL用无血清培养基稀释的CCK-8试剂，培养箱中孵育3 h；孵育完成后吸取90 μL液体转移至新的96孔板中，避光条件下酶标仪检测OD值。

1.2.7 Transwell实验：将合适密度的细胞接种到6 孔板中；待细胞完全贴壁后按照lip2000 转染说明书转染质粒或si-RNA，转染8 h后换液；转染后 48 h开始进行迁移及侵袭实验；在实验前2 h，于 4 ℃冰箱解冻缓慢解冻基质胶；用PBS稀释基质胶至终浓度为0.5 mg/mL；取出小室置于24孔板中，每小室加入200 μL基质胶，置于培养箱中孵育；转染48 h后，胰酶消化细胞并离心，用不含血清的培养基重悬并稀释细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL； 于培养箱中取出小室，吸尽PBS，每个小室加入 200 μL稀释好的细胞悬液，下室加入600 μL含10% 胎牛血清的完全培养基，水平置于培养箱中；根据不同细胞特性于特定时间取出小室，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色10 min，清水洗净后晾干；正置显微镜下观察细胞穿出情况，按上-中-左-右-下顺序取5个视野拍摄，对视野中的染色细胞进行计数并统计分析。

1.3 统计学处理方法 使用SPSS22.0软件进行统计学分析，Graphpad Prism 8.0进行实验作图，R 4.0.2进行生物信息学分析。正态分布的计量资料以表示，2 组间比较采用独立样本t检验，采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，采用Logrank检验评估2组患者生存状态的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MID2在胃癌组织中高表达并提示较差的预后 胃癌组织芯片的免疫组化染色结果表明，MID2在胃癌组织及癌旁组织中均有表达，且主要表达在细胞浆中，镜下可见MID2在癌旁组织及胃癌组织中主要表达于管状腺，且胃癌组织中呈现强阳性而癌旁组织呈现弱阳性（见图1A）。在剔除脱片、非特异性染色等情况后，28对胃癌组织与癌旁配对组织中MID2-Score的数值差异表明，MID2在胃癌中的整体表达量要高于癌旁组织（P＜0.05，见图1B）。同时配对分析显示，MID2蛋白表达水平在胃癌组织中要显著高于配对的癌旁组织（P＜0.01，见图1C）。在剔除65例脱片组织后，根据ROC曲线分析结果将胃癌患者分为MID2高表达组（101例）和MID2低表达组（254例）进行生存分析，Kaplan-Meier生存曲线显示高MID2蛋白表达水平预示着胃癌患者更差的预后（P=0.055，见图1D）。

图1 MID2在胃癌中的表达情况

对TCGA胃癌临床数据进行分析也得到了相似的结论，MID2 高表达患者的总体生存期（overall survival，OS；Log-rankP=0.002）、无病生存期（disease-free survival，DFS；Log-rankP=0.002）、无进展生存期（progression-free survival, PFS；Log-rankP=0.003）均显著低于MID2低表达患者，见图2A-C。其中在针对不同病理分期的亚组生存分析中，MID2表达量高低对于III期患者OS的影响最显著（见图2D）。这一部分结果表明MID2在胃癌组织中高表达且与胃癌患者不良预后相关，并提示其可能作为一个致癌基因在胃癌中发挥作用。

图2 TCGA胃癌数据库中MID2表达的预后分析

2.2 上调MID2表达促进胃癌细胞增殖能力 为了评估MID2对胃癌细胞恶性表型的影响，首先通过Western blot检测了MID2蛋白在各胃癌细胞系中的基础表达水平，结果表明MID2蛋白在BGC-823、SGC-7901、AGS、HGC-27表达量相近，均较低，在MGC-803细胞中表达较高。因此我们选取MID2基础表达较低的BGC-823及SGC-7901细胞系进行过表达，选取MID2基础表达较高的MGC-803细胞系进行敲低（见图3A）。我们设计构建了pcDNA3.1-MID2-HA重组质粒，将其转染至BGC-823及SGC-7901细胞中，通过Western blot实验验证质粒在细胞内有效过表达（见图3B）。随后，通过CCK-8实验证实上调MID2表达后能够显著促进胃癌细胞BGC-823和SGC-7901的增殖能力（P＜0.05，见图3C）。

图3 上调MID2促进胃癌细胞增殖能力

2.3 上调MID2表达促进胃癌细胞迁移及侵袭能力 Transwell小室迁移与侵袭实验结果显示，在过表达MID2后，BGC-823及SGC-7901细胞迁移与侵袭能力显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。以上结果证实了上调MID2表达能够显著促进胃癌细胞的迁移与侵袭能力。

图4 上调MID2促进胃癌细胞迁移、侵袭能力

2.4 下调MID2表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力 为了进一步评估MID2对胃癌细胞生物学功能的影响，我们设计了靶向MID2的小干扰RNA（siRNA），选择在MID2蛋白基础表达量较高的MGC-803细胞中验证其敲低效率。Western blot实验显示在MGC-803细胞中，siRNA能够显著敲低MID2蛋白的表达水平（见图5A）。CCK-8实验显示敲低MID2能够显著抑制胃癌细胞的增殖能力（P＜0.001），见图5B。Transwell实验表明敲低MID2的表达能够显著抑制胃癌细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.001），见图5C。

图5 敲低MID2抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力

3 讨论

细胞蛋白的泛素化在真核细胞的关键信号通路和蛋白质周转的调节中起着关键作用。在协调泛素化方面非常重要的是E3泛素连接酶，因为这些蛋白质识别及底物修饰需要发生在正确的时间和地点。TRIM是E3泛素连接酶的主要亚类。TRIMs蛋白在调节癌细胞的生物学行为方面具有重要作用[6]，如细胞内信号传导、固有免疫、细胞转录、自噬和癌变[8-10]。在肿瘤治疗过程中，TRIMs蛋白可以通过调节肿瘤的各个方面发挥作用，如肿瘤的增殖、转移、凋亡和耐药的发展等[11-12]。TRIM8、TRIM24、TRIM28和TRIM32在恶性肿瘤组织中高表达并参与恶性生物学行为[13]，并且绝大多数高表达的TRIMs蛋白提示胃肠道肿瘤患者预后不良，如胃癌组织中高表达的TRIM32[14]、TRIM54[15]等。MID2又称作TRIM1，做为TRIM家族中的一员，关于其在胃癌中的生物学效应尚缺乏足够的报道。

在本研究中，通过本中心的胃癌标本联合TCGA数据库分析显示，MID2 在胃癌组织中高表达并提示较差的预后。与本结果相似，AGUILAR等[16]报道MID2的表达与乳腺癌患者的预后有关，MID2 mRNA和蛋白水平在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中表达上 调[7]，然而除此之外，MID2 在其他肿瘤中的生物学表型及作用仍未得到足够研究。之后我们探究了MID2在胃癌细胞中的生物学效应，通过CCK-8及Transwell实验，发现上调MID2表达能显著促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，下调MID2表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。之前的研究也同样证实MID2的上调能够促进乳腺癌细胞的增殖，敲低MID2的表达显著降低乳腺癌细胞的增殖速率[6]。

关于MID2在肿瘤细胞中发挥效应的机制，有研究报道MID2通过激活NF-κB/AP-1来影响NF-κB信号通路。NF-κB是参与癌细胞过程的关键调控因子，包括细胞增殖、转移和上皮-间质转化[17-18]。除此之外，在细胞分裂期间MID2可以直接于Astrin的N-末端结合，并在以MID2依赖的方式使Astrin-K409处泛素化，最终导致Astrin降解从而促进细胞的分裂[19]。 这将可能是MID2促进肿瘤细胞增殖机制探索的切入点。而关于MID2通过何种机制进而影响胃癌细胞表型，仍是我们需要思考并进行后续研究的重点。

综上所述，我们发现MID2在胃癌组织中表达上调，且与胃癌患者的不良预后密切相关。上调MID2能显著促进胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力，但其发挥生物学功能的具体机制有待进一步研究。