黑水虻对金霉素菌渣的降解调控分析

王 会, 郑朝中, 陈玉梁, 王 飞,*, 王雷雨,章启慧, 黄俊魁, 赵浚丞

(1. 中国热带农业科学院农产品加工研究所, 湛江 524001; 2. 江西农业大学生物科学与工程学院, 南昌 330045;3. 四川扬运生物科技集团有限公司, 成都 610000)

目前国内畜禽养殖业呈规模化、集约化发展态势(赵彦岭, 2017)。兽用抗生素常作为抗菌药物和生长促进剂被用于畜禽养殖过程中,但抗生素的过度使用会造成细菌耐药性和环境污染等一系列问题(Wangetal., 2019)。作为广谱性抗生素,四环素类抗生素涵盖金霉素、四环素、土霉素、地美环素及其衍生物等被广泛用于畜禽养殖业(于晓雯等, 2021)。其中,金霉素在促进畜禽类生长和预防疾病方面效果显著,是畜禽养殖业的首选抗生素。金霉素在发酵生产过程中残余的固体废弃物统称为金霉素菌渣(chlortetracycline residue),据统计,生产1吨金霉素平均产生40吨湿菌渣(陈冠益等, 2021)。菌渣中含有丰富的菌体蛋白(含量在20%～50%)及C, P和S等元素,但也含有大量菌丝体、发酵代谢产物、培养基降解物和金霉素残留等(邹书娟等, 2018)。由于金霉素菌渣有机物含量高,常用作畜禽饲料添加,但金霉素进入动物体内仅少部分被吸收利用,大部分以原形或代谢产物的形式被排出,导致畜禽粪便中金霉素的残留量较高。80%以上的畜禽粪便未经分解就被直接施用田间,破坏了土壤微生物的平衡。因此菌渣饲料化应用仍具有一定的风险。国内外处理抗生素菌渣主要有高温焚烧(孙秀艳, 2017)、堆肥化处理(Renetal., 2019)、厌氧消化处理(蒋明烨等,2017)、化学处理(Wangetal., 2022)、微生物处理(Zhongetal., 2014)等方法,上述处理方法各有优缺点,如高温焚烧因菌渣含水量高,脱水、热解过程耗能高、设备要求高,而且产生的废气易造成二次污染;物理填埋菌渣因腐化、液化产生的渗滤液,易造成水污染和土壤污染; 厌氧消化因其反应模式对设备和设施较高,工艺较为繁琐,成本高,不利于应用推广;化学氧化则因能耗大,成本高,易造成副产物二次污染不适宜广泛应用。微生物处理效果较为明显,而且不易产生二次污染,但对高产菌种选育、高效酶解功能要求较高,技术成熟度有待提高。因此,寻求科学有效的抗生素菌渣无害化处理技术是我国抗生素生产企业迫切需要解决的问题。

生物转化技术是指通过植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器,以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。其中,资源昆虫黑水虻Hermetiaillucens通过新陈代谢转化餐厨垃圾、畜禽粪便等有机废弃物的处理模式成为行业发展重点(纪佳雨等, 2021),也为金霉素菌渣降解处理提供新的思路。黑水虻处理农业有机废弃物具有转化速度快、转化效率高、处理成本低、无二次污染等优点,且产生的副产物应用潜力大,因此,该模式受到了国内外学者的广泛关注。目前,关于黑水虻的研究主要集中在生物学生长特性(El-Dakaretal., 2021; Pliantiangtametal., 2021)、生物转化机制(Meneguzetal., 2018)、饲料化应用(Wang and Shelomi, 2017)等方面,而对基料中抗生素、重金属、农药等有害物质的降解机制或积累效应的研究报道较少。比较分析磺化木质素,纤维素、几丁质、啤酒糟(富含蛋白质)、葵花油等有机废物的混合物饲养黑水虻,表明黑水虻幼体生长以及抗菌肽基因表达受饲养基质影响(Vogeletal., 2018)。Kar等(2021)的研究表明,在猪饲料中通过黑水虻虫粉替代100%豆粕能够使生长猪的血浆中的有益活性物质L-α-氨基丁酸和牛磺酸含量显著上升。黑水虻幼虫对霉菌毒素、农药(Purschkeetal., 2017)和黄曲霉毒素(Boschetal., 2017)具有一定的降解作用。金霉素菌渣中富含丰富的蛋白、油脂等营养成分(陈冠益等, 2021),但残留金霉素限制了其资源化利用,鉴于黑水虻幼虫可高效转化有机废弃物中的蛋白质和油脂等营养成分,因此开展黑水虻对金霉素菌渣的生物转化研究,对黑水虻幼虫生物学价值开发和金霉素菌渣的无害化利用研究均具有重要意义。

本研究以黑水虻为研究对象,通过生物转化技术降解金霉素菌渣,考察幼虫周期性生长特性、金霉素降解率,系统评价金霉素菌渣对幼虫生长特性的影响机制,以及黑水虻对金霉素的降解调控机制,从而揭示黑水虻生物转化法对金霉素菌渣的降解作用,为我国抗生素生产企业提供科学有效的菌渣无害化处理新思路。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及饲养

黑水虻虫卵由四川扬运生物科技集团有限公司提供。选取同一天收集的黑水虻卵,按0.5 g每组,随机分21组,分别置于40目筛网孵化架上,筛网下为黑水虻虫卵孵化盒,盒重为100 g(干重),含水量为80%的麦麸孵化料,依据实验室前期最适宜养殖条件,将孵化盒置于恒温恒湿实验室(温度28 ℃,相对湿度70%)进行孵化培育。

幼虫培育至3日龄后,将其转入含不同配比的麦麸和金霉素菌渣养殖料(表1)中(金霉素菌渣与麦麸营养成分如表2),置于温度25 ℃,相对湿度40%环境中进行饲养。每个处理分别设置3个平行,如表1所示。养殖处理期间,每日定时进行一次翻料处理,从第5天开始,每隔1 d记录幼虫体长和体重。7日龄开始每隔1 d收集一次黑水虻幼虫及养殖残料,存于-80 ℃冰箱备用。饲养幼虫至开始出现预蛹,实验结束,用8目筛网对各处理组虫料分离,对幼虫进行24 h饥饿处理并清洗,将幼虫与养殖残料置于-80 ℃冰箱备用。

表1 混合养殖料中麦麸与金霉素菌渣不同质量配比Table 1 Different mass ratios of wheat bran to chlortetracycline residue in the mixed diets

表2 金霉素菌渣与麦麸营养成分分析Table 2 Analysis of nutritional components of chlortetracycline residue and wheat bran

1.2 供试仪器和试剂

1.2.1仪器:高效液相色谱仪(型号为LC-20A),配有紫外检测器(型号为SPD-M20 A);自动进样器(型号为SIL-20A)购自Shimadzu公司;分析天平(型号为Auy220)购自湛江科铭科技有限公司;HLB Pro SPE固相萃取小柱购自CNW公司;低温离心机(型号为3- 30K)购自Sigma公司;烘箱(型号为EDS-7-118)购自Thermo公司;旋涡混匀器(型号为IKA MS3)购自上海川翔生物科技有限公司;高速多功能粉碎机(型号为700Y),购自武义海纳电器有限公司。

1.2.2试剂:金霉素菌渣由浦城正大生化有限公司提供;麦麸购自湛江市霞山区农贸市场;金霉素标准品(纯度≥99.5%)购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司;无水草酸、一水合柠檬酸、乙二胺酸四乙酸二钠、十二水合磷酸氢二钠均为国药集团分析纯;甲醇和乙腈为色谱纯,均购自Fisher公司。

1.3 幼虫体长和体重测量

测量时,用镊子随机挑取每个处理组中的50头幼虫,置于培养皿中,洗净幼虫表面附着物,吸干水分后,采用游标卡尺和分析天平分别测量幼虫体长与体重。

1.4 样品前处理

每个处理组停止实验后,将幼虫和养殖残料置于60 ℃烘箱中进行48 h多次翻动干燥,高速多功能粉碎机粉碎过40目。称取粉碎幼虫样品2.0 g,置于50 mL离心管中,加入20 mL Mcllvaine缓冲液,涡旋震荡5 min,低于15 ℃ 10 000 r/min离心5 min;移取上清液,在剩余残渣中分别加入15 mL Mcllvaine缓冲液重复提取两次,合并上清液,并定容至50 mL混匀。将提取液用快速滤纸过滤,收集滤液,吸取10 mL滤液经HLB固相萃取柱净化,用3 mL甲醇洗脱,0.22 μm滤膜过滤后上机。

1.5 金霉素含量检测

采用高效液相色谱仪检测黑水虻幼虫及养殖残渣中金霉素含量,色谱条件为:色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:A为草酸水溶液(0.01 mol/L),B为甲醇∶乙腈(1∶1);检测波长:365 nm;柱温箱温度:30 ℃;柱流量:1.0 mL/min;进样量10 μL。流动相梯度洗脱见表3。用色谱级甲醇配制金霉素浓度分别为1, 5, 10, 50和100 mg/L的标准溶液,在高效液相色谱仪上进行测定后,分析金霉素溶液浓度对应峰面积标准曲线,在检测浓度梯度内,线性关系良好,符合标准定量要求。标准曲线回归方程为y=38 122x-36 561,相关系数R2=0.9977。

表3 流动相梯度洗脱Table 3 Mobile phase gradient elution

上述检测条件,测得金霉素初始含量为346.78 μg/g。

1.6 金霉素菌渣的降解率测定

根据测定不同处理组幼虫及养殖残料中金霉素含量,采用下述公式计算各处理组金霉素菌渣降解率:

M养殖料: 养殖料中金霉素含量;M幼虫: 幼虫体内金霉素含量;M残料: 养殖残料的金霉素含量。

1.7 数据分析

实验数据统计及作图用GraphPad Prism 8.00(GraphPad Software,美国)进行,采用IBM SPSS Statistics 21.0软件,用单因素方差分析对实验数据进行差异性分析,P<0.05表明两者之间差异显著。

2 结果

2.1 不同金霉素菌渣含量的养殖料对黑水虻幼虫体重的影响

图1表示金霉素菌渣含量对黑水虻幼虫体重变化的影响。依次向黑水虻3日龄幼虫中添加不同比例的麦麸和金霉素菌渣养殖料,由于纯菌渣中金霉素含量过高,从而导致添加后麦麸与金霉素菌渣 0∶1混合养殖料饲养的黑水虻幼虫逐渐出现死亡现象,直至5日龄时幼虫全部死亡,因此,未设计纯金霉素菌渣进行下一阶段实验。

图1 混合养殖料中金霉素菌渣含量对黑水虻幼虫体重变化的影响Fig. 1 Influence of the content of chlortetracycline residue in the mixed diet on the change of body weight of Hermetia illucens larvae1∶0, 1∶1, 2∶1, 5∶1, 10∶1, 20∶1: 麦麸与金霉素菌渣不同质量比Different mass ratios of wheat bran to chlortetracycline residue. 下图同。The same for the following figures. 图中数据为平均值±标准误; 柱上不同小写字母表示麦麸与金霉素菌渣不同质量配比混合养殖料饲养的同日龄幼虫的参数差异显著(P<0.05, 单因素方差分析)。下图同。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars represent significant difference in the same parameter of the same day-old larvae reared with the mixed diets of wheat bran and chlortetracycline residue in different mass ratios (P<0.05, one-way ANOVA). The same for the following figures.

从图1可以看出,麦麸与金霉素菌渣不同质量配比混合养殖料饲养的3日龄幼虫体重无显著差异(P>0.05)(图1)。7日龄时,20∶1和5∶1质量配比组幼虫体重无显著性差异(P>0.05),但增加至11日龄时,20∶1质量配比幼虫体重增长较快,与其他组具有显著性差异(P<0.05), 2∶1, 5∶1和10∶1质量配比组无显著性差异(P>0.05)(图1)。随着幼虫日龄达到11日时,部分幼虫进入预蛹阶段,开始排空肠道为预蛹做准备,进食量减少,体内营养累计减少,故11日龄后体重降低。麦麸与金霉素菌渣5∶1, 10∶1和20∶1质量配比混合养殖料饲养的5, 7, 9, 11和13日龄幼虫体重高于对照组(1∶0质量配比组,纯麦麸饲养组),而麦麸与金霉素菌渣1∶1和2∶1质量配比混合养殖料饲养的5, 7和9日龄幼虫体重显著低于对照组(P<0.05)(图1)。因此,当麦麸与金霉素菌渣质量比高于5∶1时,7-13日龄体重相对于纯麦麸饲养组具有不同程度增加(图1)。

2.2 不同金霉素菌渣含量的养殖料对黑水虻幼虫体长的影响

不同金霉素菌渣含量的养殖料对黑水虻幼虫体长的影响如图2所示。结果表明,麦麸与金霉素菌渣不同质量配比混合养殖料饲养的不同日龄黑水虻幼虫体长变化呈现和体重变化基本一致的趋势。3日龄幼虫体长在各质量配比菌渣组之间无显著差异(P>0.05),随着处理时间的推移,各质量配比组的体长增加,至13日龄时各质量配比菌渣组体长开始减少(图2)。同时,纯麦麸组(1∶0质量配比组,对照组)中5, 7和9日龄幼虫体长显著高于麦麸与金霉素菌渣1∶1和2∶1质量配比组(P<0.05);9日龄后体长增长速率变缓,增长速率由9日龄的46.11%降低为11日龄的3.67%,但菌渣组幼虫体长仍缓慢增长。13日龄时,各组幼虫体长开始减少,20∶1菌渣组幼虫体长显著高于其他各组的(P<0.05)。结果表明底物金霉素含量对低龄幼虫生长特性影响更加显著,这是由于其对环境适应性造成的。

图2 混合养殖料中金霉素菌渣含量对黑水虻幼虫体长变化的影响Fig. 2 Influence of the content of chlortetracycline residue in the mixed diet on the change of body length of Hermetia illucens larvae

2.3 黑水虻对金霉素的降解效果

采用高效液相色谱仪检测菌渣干燥后金霉素含量为346.78 μg/g。在相同条件下测定不同日龄黑水虻幼虫及养殖残料中金霉素含量,通过1.6节公式计算金霉素降解率。由于黑水虻幼虫对金霉素的耐受能力与浓度密切相关,在高浓度下存活率降低,这与实验结果相一致,纯菌渣组中黑水虻5日龄幼虫全部死亡。因此,重点研究麦麸与金霉素菌渣5∶1, 10∶1和20∶1质量配比组对金霉素的降解效果。表4为高效液相色谱仪检测的3日龄幼虫养殖料中的金霉素初始含量以及不同日龄幼虫中与不同日龄幼虫养殖残料中的金霉素含量。麦麸与金霉素菌渣20∶1质量配比组低浓度金霉素初始含量条件下,幼虫中金霉素含量逐渐增加,至11日龄时达到稳定状态。但浓度较高时,麦麸与金霉素菌渣5∶1和10∶1质量配比组黑水虻幼虫中金霉素含量先降低,后升高至稳定状态。另一方面,不同质量配比组养殖残料中金霉素含量均随日龄增加逐渐降低。

表4 黑水虻幼虫及养殖残料中金霉素含量Table 4 Chlortetracycline contents in larvae and diet residues of Hermetia illucens

由图3可以看出,金霉素的降解率随日龄增加均呈现先增高后降低的趋势,在9日龄达到峰值。这是由于受黑水虻幼虫进食速度和新陈代谢规律影响,从7日龄到9日龄各组金霉素降解率显著升高(P<0.05),但随着日龄的推移,黑水虻新陈代谢过程逐渐变慢,降解能力也逐渐降低。麦麸与金霉素菌渣5∶1质量配比组7, 9, 11和13日龄黑水虻幼虫对金霉素的降解率分别为39.21%, 68.94%, 66.53%和68.26%,显著高于麦麸与金霉素菌渣10∶1和20∶1质量配比组的(P<0.05)(图3),表明金霉素含量对于黑水虻幼虫降解金霉素具有显著影响(P<0.05),随着金霉素含量的增加,抗性菌富集导致其降解率升高,这与真菌毒素在黑水虻幼虫体内的潜在积累研究结果一致。

图3 不同质量配比麦麸与金霉素菌渣混合养殖料饲养的不同日龄黑水虻幼虫对金霉素的降解率Fig. 3 Degradation rates of chlortetracycline by different day-old larvae of Hermetia illucens reared with the mixed diets of wheat bran and chlortetracycline residue in different mass ratios

3 讨论与结论

本研究通过黑水虻降解金霉素菌渣,系统研究了金霉素含量对黑水虻幼虫生长特性以及降解率的影响。结果表明,在5-11日龄生长阶段体重和体长与日龄呈正相关(图1, 2),此阶段为幼虫快速成长期,该阶段黑水虻幼虫取食量及对基质中的营养吸收能力逐渐增加,幼虫体内营养物质积累量增加,各组虫重与虫长随日龄增加呈增长趋势,这与体重、体长与摄入的营养成分的积累量呈正相关的结论(黄友良和欧玲利, 2019)相一致。同时,金霉素作为一种抗生素,自身抑菌作用能够抑制低日龄黑水虻幼虫肠道微生物繁殖与生长,从而影响黑水虻幼虫消化吸收有机质能力。黑水虻可以根据环境变化而进行自我调节与适应,在不同环境下逐渐适应,进而转化利用养殖料中的营养,获得幼虫自身的生长发育(Brunoetal., 2019)。因此随着幼虫生长,体内肠道微生物逐渐适应了对金霉素产生一定的耐药性,从而促进了幼虫对有机质的吸收和代谢能力(Bertinettietal., 2019)。但金霉素菌渣相对含量对黑水虻幼虫生长特性、生长周期及预蛹均存在影响。相对于高龄幼虫,金霉素对低龄幼虫的生理毒性作用更大,这与幼虫对于抗生素的耐受程度有关。在低龄幼虫阶段,体长与体重受到的抑制作用随浓度的升高而增加,但到了高龄幼虫阶段,这种抑制作用逐渐消失(沈媛等, 2012)。当黑水虻幼虫超过13日龄时,部分幼虫进入预蛹阶段,体内营养累计减少导致13日龄各组幼虫的虫长和虫重减少(黄友良和欧玲利, 2019)。

当黑水虻幼虫参与有机质转化过程时,抗生素的降解效率与有机质的消化呈正相关,表明抗生素降解是随着有机质消化吸收在黑水虻幼虫肠道中同时进行(Kogut and Arsenault, 2016; Varottoetal., 2017)。Cai等(2018b)由于受黑水虻幼虫进食速度和新陈代谢规律的影响,黑水虻对金霉素的降解率随着日龄的增加呈现先升高后降低的趋势。黑水虻幼虫对金霉素的降解率受金霉素浓度的影响明显,高浓度的金霉素提高了黑水虻幼虫的降解率,这是由于随着金霉素浓度的增加,抗性菌富集导致其降解率升高(图3)。这与真菌毒素在黑水虻幼虫体内的潜在积累研究结果一致。在饲料中加入黄曲霉毒素、呕吐毒素、赭曲毒霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素以及上述毒素的混合物,黑水虻取食饲料后,仅在黑水虻幼虫中检测到比饲料中低几个数量级的含量,表明黑水虻幼虫对上述4种真菌毒素进行不同程度的代谢(Caietal., 2018a)。另一方面,相比于传统降解方式,黑水虻生物转化方法效率更高。牛粪中金霉素在不同厌氧消化温度(22, 38和55 ℃)下经28 d厌氧消化,去除率分别为3%, 8%和27%(Inceetal., 2013)。本研究中麦麸与金霉素菌渣5∶1质量配比组在7-13日龄对金霉素的降解率分别达到39.21%, 68.94%, 66.53%和68.26%(图3),远高于传统厌氧发酵,为黑水虻生物学价值开发和金霉素菌渣无害化处理提供了新的思路。