共生菌Serratia symbiotica对豌豆蚜发育和繁殖的影响

李月明, 张永栋, 宫厚艳, 吕志强

(西北农林科技大学植物保护学院, 杨凌 712100)

共生(symbiosis)是不同生物间形成的紧密联系(Moran and Yun, 2015)。共生细菌在动物宿主体内广泛存在,它们在宿主的生长发育(Koropatnicketal., 2004)、营养摄取(Bäckhedetal., 2005)、繁殖(Bandietal., 2001)、抵御天敌(Scarboroughetal., 2005)和免疫过程(MacDonald and Monteleone, 2005)中发挥重要作用。在一些脊椎动物中,共生菌经母系遗传了上百万年(Moranetal., 2008)。这些共生菌与宿主高度融合,基因组大幅度减小,它们更像宿主的细胞器(Moran and Yun, 2015)。昆虫和哺乳动物相比,其体内微生物较少,因此成为研究共生菌以及寄主-共生菌关系的绝佳模型(Douglas, 2011)。昆虫共生菌依据其在宿主体内的位置分为两类:一类是内共生菌,它们生活在昆虫细胞内,如沃尔巴克氏体Wolbachia;一类是外共生菌,它们存在于昆虫细胞外,如一些肠道菌群(王四宝和曲爽, 2017)。

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum体内含有专性共生菌Buchneraaphidicola和1种或多种兼性共生菌,是研究得较为透彻的共生体系之一(Oliveretal., 2014),其中豌豆蚜与其专性共生菌B.aphidicola是探究专性共生关系的模式。B.aphidicola高度精简的基因组保留了一些基因,其自身能够合成蚜虫食物中短缺的营养物质,如氨基酸和维生素B等(Shigenobuetal., 2000)。豌豆蚜体内共生体膜上的一种氨基酸运输载体ApNEAAT1能够双向转运极性氨基酸,为宿主和共生菌提供充足的营养物质(Fengetal., 2019)。去除B.aphidicola的蚜虫生长缓慢,很难产下后代,产下的后代也难以存活(Tsuchidaetal., 2005)。兼性共生菌虽然不是宿主生存必需的,但它们对宿主的适合度有显著影响(Oliveretal., 2006)。早期有研究表明,豌豆蚜的次生共生菌(pea aphid secondary symbiont, PASS)后被鉴定为Serratiasymbiotica,能够使宿主在失去B.aphidicola后正常存活,并能够侵入B.aphidicola的含菌细胞,建立新的内共生系统,进而取代专性共生菌的位置(Kogaetal., 2003)。近年来的研究表明,兼性共生菌的营养合成基因能够水平转移到寄主蚜虫内,从而提高蚜虫的适合度(Manzano-Maretal., 2020)。含有S.symbiotica的豌豆蚜在取食的时候能避免激发植物钙离子流的产生,逃避植物免疫,更好地吸取植物汁液(Wangetal., 2020)。最近有直接的证据表明S.symbiotica能通过增强脂肪酸的合成途径来促进豌豆蚜的生长发育(Zhouetal., 2021)。在一些蚜虫种群中S.symbiotica已经发展成与B.aphidicola共专性(co-obligate)的关系,它们作为一个协同的整体表达合成提供营养的基因(Monninetal., 2020)。本研究利用注射抗生素的方式去除了豌豆蚜体内的兼性共生菌S.symbiotica,检测了去除S.symbiotica后豌豆蚜体内专性共生菌B.aphidicola含量,最后检测了豌豆蚜的生活史参数的变化。本研究确定了利用抗生素去除豌豆蚜兼性共生菌S.symbiotica的可行性,加深了对豌豆蚜和其体内共生菌之间关系的理解。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

由于绿色豌豆蚜在我国分布广泛,本研究选取饲喂于蚕豆苗上的绿色豌豆蚜(以下统称“豌豆蚜”)为试验对象,种群采集于云南省玉溪市易门县(24°35′N, 102°55′E),在实验室条件下饲喂了30代以上。将饱满、生理状态良好的豌豆蚜成蚜接于单株蚕豆苗上,每株约接10～15头成蚜,将蚕豆苗放入人工气候箱中[温度(20±1) ℃,相对湿度70%±5%,光周期16L∶8D]饲养,1 d后将接的成蚜取下,保证产下的若蚜龄期差在24 h内,产下的若蚜再饲喂7～8 d,待其发育为成蚜后用于后续试验。

1.2 诊断PCR检测豌豆蚜兼性共生菌类型

除了专性共生菌,豌豆蚜体内一般还有1～2种兼性共生菌。为了检测实验室豌豆蚜品系中兼性共生菌的类型,按照基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明提取1.1节整头豌豆蚜成蚜基因组DNA,并以此为模板,利用8种兼性共生菌的特异性基因扩增引物(表1)参照张永栋(2017)的方法进行PCR检测,将反应得到的PCR原液送公司测序,进行BLAST检验,确定兼性共生菌的类型。反应体系(50 μL): Taq酶(TaKaRa) 0.25 μL, 10×PCR缓冲液5 μL, dNTPs混合液4 μL, DNA模板1.75 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, H2O 37 μL。反应程序: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 52 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 35个循环。

表1 诊断PCR引物信息Table 1 Primer information for diagnostic PCR

1.3 豌豆蚜饲喂氨苄青霉素

向人工饲料中添加不同剂量氨苄青霉素后饲喂豌豆蚜成蚜,检测亲代成蚜及其子代的若蚜体内是否存在S.symbiotica。将初羽化的雌成蚜挑入48孔板,每孔放1头蚜虫。将石蜡膜(紫外下灭菌)拉伸开套在48孔板上。把豌豆蚜人工饲料和一定量的氨苄青霉素溶液混合,使氨苄青霉素终浓度分别为50和500 μg/mL。向延展后的石蜡膜上每个孔的中央加入含有氨苄青霉素的饲料,再将一层石蜡膜拉伸开覆盖住所有液滴。将双层石蜡膜覆盖的48孔板放入培养箱中在黑暗条件下饲喂,以未饲喂氨苄青霉素的豌豆蚜成蚜作为阳性对照。待豌豆蚜取食24和48 h时收集亲代蚜虫,将这段时间内产下的子代若蚜转移至新鲜蚕豆苗上饲养,待其产下后代后收集其子代若蚜为样品,提取子代若蚜及亲代基因组DNA并进行PCR(同1.2节),检测其中的兼性共生菌。

1.4 豌豆蚜注射氨苄青霉素及无兼性共生菌品系的筛选

用显微注射仪向成蚜体内注射23和46 nL 300 mg/mL的氨苄青霉素,收集注射后24-48 h产下的子代G1。将G1转移至新鲜蚕豆叶片,分开单头饲养至成蚜并产生一定数量的后代G2。提取G1基因组DNA并进行PCR,检测其中的兼性共生菌。随机挑选几头G2后代,用同样的方法饲养,获得后代G3。PCR检测G2和G3中的兼性共生菌,通过连续3代的检测确定兼性共生菌S.symbiotica被清除干净,PCR反应体系和反应程序同1.2节,阴性对照的PCR体系中不加入DNA模板,将G3后代接于干净的蚕豆苗上建立无兼性共生菌豌豆蚜品系。隔一定时间对无兼性共生菌品系的成蚜进行检测,以确定无兼性共生菌豌豆蚜种群的稳定。

1.5 专性共生菌B. aphidicola含量的检测

为了检验去除S.symbiotica对豌豆蚜体内的专性共生菌有无影响,检测了含有S.symbiotica和1.4节构建的不含S.symbiotica的品系中B.aphidicola的含量。选取10头豌豆蚜成蚜作为样品提取DNA,以B.aphidicola的单拷贝基因dnaK为目的基因进行qPCR检测dnak拷贝数,测定含有和不含S.symbiotica的豌豆蚜成蚜体内B.aphidicola的含量。反应体系(20 μL): 2×Green Master Mix(Roche) 10 μL, DNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, ddH2O 8 μL。反应程序: 94 ℃预变性10 min; 94 ℃变性10 s, 58 ℃退火15 s, 72 ℃延伸10 s, 40个循环。进行T-A克隆构建含dnaK基因片段的质粒,以此制备标准品并梯度稀释,生成标准曲线。用绝对定量的方法计算每个样品目的基因的DNA浓度,并通过豌豆蚜ef1-α归一化各样品DNA含量来校正B.aphidicola的浓度(Oliveretal., 2003)。引物序列见表2。

表2 qPCR引物信息Table 2 Primer information for qPCR

1.6 豌豆蚜生活史参数的测定

从含有和不含S.symbiotica的豌豆蚜中随机选择新产的1龄第1天的若蚜,每5头为1组称重,共取5组。选择叶片肥厚的蚕豆叶片,沿叶脉剪开,叶片背面朝下平铺于装有1%琼脂的塑料盒(8.5 cm×5.5 cm×2.5 cm)中,将称量后的豌豆蚜放于其中饲喂。塑料盒放于人工气候培养箱中,每隔2 d换一次新的琼脂和叶片,之后在第1, 3, 5, 7和9天检测豌豆蚜的体重。从第1天开始,统计25头豌豆蚜中每天死亡的豌豆蚜数目,直到第13天,计算死亡率。从第2天开始,每两天统计塑料盒25头豌豆蚜中蜕皮数,直到所有豌豆蚜发育为成虫。在两个豌豆蚜品系中个选10头成蚜,统计它们3 d内产的后代数量和后代死亡数量。

1.7 数据分析

检测含有和不含S.symbiotica的豌豆蚜生活史参数时,每头豌豆蚜作为1次生物学重复,数据用GraphPad Prism 8.0.2分析作图:存活率数据通过log-rank(Mantel-Cox)进行分析,其他数据采用非配对t检验进行分析;检测共生菌含量时qPCR结果通过方差齐性检测确定方差齐性,用软件SPSS 20.0进行分析作图,分析方法为两因素方差分析(two-way ANOVA)。

2 结果

2.1 豌豆蚜成蚜中兼性共生菌的检测

豌豆蚜兼性共生菌PCR检测结果(图1)显示,仅扩增到1条约500 bp条带,PCR产物测序对比结果表明,扩增产物为S.symbiotica特异基因16S rDNA序列,表明豌豆蚜兼性共生菌是S.symbiotica。因此,本研究中所用的豌豆蚜品系仅含有1种兼性共生菌S.symbiotica。

图1 豌豆蚜成蚜中兼性共生菌基因PCR检测Fig. 1 PCR detection of genes of faculative symbionts in Acyrthosiphon pisum adultsM: DNA分子量标准DNA molecular weight marker; 1-8: 检测的共生菌基因分别为Hamiltonella defensa, Regiella insecticola, Serratia symbiotica, APXS, Rickettsia sp., Spiroplasma sp.和Rickettsiella sp. 的16S rDNA基因及Wolbachia sp.的wsp基因。The detected genes of symbionts were 16S rDNA of Hamiltonella defensa, Regiella insecticola, Serratia symbiotica, APXS, Rickettsia sp., Spiroplasma sp. and Rickettsiella sp., and wsp of Wolbachia sp., respectively.

2.2 不含兼性共生菌S. symbiotica的豌豆蚜品系的建立

PCR检测结果显示,给豌豆蚜连续饲喂含50 μg/mL氨苄青霉素人工饲料后24 h时并不能去除亲代与子一代若蚜体内的S.symbiotica,所有子代若蚜中都存在S.symbiotica的16S rDNA基因(图2: A, B)。加大饲喂氨苄青霉素的剂量和时间,检测给豌豆蚜连续饲喂含500 μg/mL氨苄青霉素人工饲料后48 h时母代与子代若蚜体内S.symbiotica减少(图3: A, B),但是去除效果仍不够理想。

图2 饲喂含50 μg/mL氨苄青霉素人工饲料后24 h时豌豆蚜亲代(A)和子代若蚜中(B)Serratia symbiotica16S rDNA基因的PCR检测Fig. 2 Detection of Serratia symbiotica 16S rDNA gene in parents (A) and offspring nymphs (B) of Acyrthosiphonpisum at 24 h after feeding with the artificial diet containing 50 μg/mL ampicillin by PCRM: DNA分子量标准DNA molecular weight marker; Pc: 阳性对照(未饲喂氨苄青霉素的豌豆蚜成蚜) Positive control (A. pisum adults without feeding of ampicillin). 图3同。The same for Fig. 3. A1-A4: 4头饲喂了氨苄青霉素的亲代成蚜 Four parental adult aphids fed with ampicillin; A11-A13: A1产的3头子代若蚜Three offspring nymphs of A1.

图3 饲喂含500 μg/mL氨苄青霉素人工饲料后48 h时豌豆蚜亲代(A)和子代若蚜中(B)Serratia symbiotica 16S rDNA基因的PCR检测Fig. 3 Detection of Serratia symbiotica 16S rDNA gene in parents (A) and offspring nymphs (B) of Acyrthosiphonpisum at 48 h after feeding with the artificial diet containing 500 μg/mL ampicillin by PCRB1, B2: 饲喂了氨苄青霉素的亲代成蚜Parental adult aphids fed with ampicillin; A11-A22: B1, B2产在石蜡膜上的后代若蚜Offspring nymphs produced on paraffin membranes by B1 and B2; B11, B12, B21, B22: B1和B2产于蚕豆苗上的后代若蚜Offspring nymphs produced on broad bean seedlings by B1 and B2.

给豌豆蚜成蚜注射23 nL 300 mg/mL氨苄青霉素后,6个子代中有2个子代体内没有扩增到S.symbiotica的16S rDNA基因,表明不含S.symbiotica。给豌豆蚜注射46 nL 300 mg/mL氨苄青霉素后,6个子代中有4个子代体内没有扩增到S.symbiotica的16S rDNA基因,表明不含S.symbiotica(图4)。结果表明通过注射氨苄青霉素能够去除部分子代中的S.symbiotica,建立了不含兼性共生菌S.symbiotica的豌豆蚜品系,并且这种去除效果随剂量增加更有效。

图4 豌豆蚜成蚜注射氨苄青霉素后G1子代中Serratia symbiotica 16S rDNA基因的PCR检测Fig. 4 Detection of Serratia symbiotica 16S rDNA gene in G1 offspring of Acyrthosiphon pisum adults after injecting ampicillin by PCRM: DNA分子量标准DNA molecular weight marker; 1-6: 注射23 nL 300 mg/mL氨苄青霉素23 nL 300 mg/mL ampicillin injected; 7-12: 注射46 nL 300 mg/mL氨苄青霉素46 nL 300 mg/mL ampicillin injected; 13: 无DNA模板的阴性对照Negative control without DNA template.

2.3 含有和不含S. symbiotica的豌豆蚜成蚜中B. aphidicola含量

结果显示,含有S.symbiotica和构建的不含S.symbiotica的成蚜品系中dnaK的拷贝数无显著差异(P>0.05),表明去除S.symbiotica对豌豆蚜体内专性共生菌B.aphidicola含量无影响(图5)。

图5 含有和不含Serratia symbiotica的豌豆蚜成蚜中专性共生菌Buchnera aphidicola的dnaK的拷贝数Fig. 5 Copy numbers of dnaK of the obligate symbiont Buchnera aphidicola in Acyrthosiphon pisum adults with and without Serratia symbioticaSs-: 不含S. symbiotica Without S. symbiotica; Ss+: 含有S. symbiotica With S. symbiotica. 图6同。The same for Fig.6. 图中数据为平均值±标准误;柱上ns表示两组间差异不显著(P>0.05, t检验)。Data in the figure are mean±SE. ns above bars indicate no significant difference between the two groups (P>0.05, t-test).

2.4 含有和不含S. symbiotica的豌豆蚜生活史参数

不含S.symbiotica的豌豆蚜新产的1龄第1天若蚜体重就显著低于含有S.symbiotica的豌豆蚜的(P<0.05),第3天时其体重极显著低于含有S.symbiotica的豌豆蚜的(P<0.001)。含有S.symbiotica的豌豆蚜在出生后第7-9天时其体重上升得很快,而不含S.symbiotica的豌豆蚜体重上升得很慢,到第9天时其体重不到含有S.symbiotica的豌豆蚜体重的1/3(图6: A)。在出生后第2天时,接近90%的含有S.symbiotica的豌豆蚜发生蜕皮,说明90% 含有S.symbiotica的豌豆蚜进入了2龄, 而不含S.symbiotica的豌豆蚜仅有不到 40%蜕皮;在第4, 6和8天时,两组豌豆蚜蜕皮率无显著差异(P>0.05),但在第8天时所有含有S.symbiotica的豌豆蚜都发育为成虫,而不含S.symbiotica的豌豆蚜还有约50%到第10天才经历最后一次蜕皮发育成成虫(图6: B)。死亡率统计结果显示, 含有S.symbiotica的豌豆蚜在出生后13 d内死亡率10%,而不含S.symbiotica的豌豆蚜死亡率40%(图6: C)。含有S.symbiotica的豌豆蚜成蚜在3 d内产后代总数约为21头,极显著高于不含S.symbiotica的豌豆蚜产后代数(约6头)(P<0.001),另外含有S.symbiotica的豌豆蚜产下的后代死亡数量很少,显著低于不含S.symbiotica的豌豆蚜(P<0.05)(图6: D)。

图6 含有和不含Serratia symbiotica的豌豆蚜生活史参数Fig. 6 Life history parameters of Acyrthosiphon pisum with and without Serratia symbioticaA: 体重Body weight (n=25); B: 蜕皮率Rate of ecdysis(n=25); C: 13 d内的死亡率Mortality rates within 13 d (n=25); D: 后代数量Offspring number (n=10). 图中数据为平均值±标准误;A, B和D图采用非配对t检验,C图采用Log-rank(Mantel-Cox)检验进行差异显著性分析(nsP>0.05, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。Data in the figure are mean±SE. Unpaired t-test was used in Figs. A, B and D, and Log-rank (Mantel-Cox) test was used in Fig. C to conduct significance analysis of difference (nsP>0.05, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001).

3 讨论

研究表明一部分兼性共生菌会向蚜虫收取适合度代价,影响其生长发育、寿命和繁殖(Sakuraietal., 2005; Mathé-Hubertetal., 2019; Leybourneetal., 2020)。但在本研究中,兼性共生菌S.symbiotica的存在却有利于豌豆蚜的生长发育与繁殖。这样的结果与Zhou等(2021)的研究结果相似,他们发现S.symbiotica能通过提高脂肪酸合成、增加三酰甘油的储存促进豌豆蚜的生长发育。但Kang等(2022)的研究发现,去除S.symbiotica并不会影响豌豆蚜的生长发育和繁殖。这种冲突可能是由于S.symbiotica菌株与蚜虫进化出了多样的关系,不同地区不同品系的S.symbiotica在蚜虫体内占据不同的地位。它们与蚜虫的关系可以处于致病、兼性互利共生或与B.aphidicola共存的专性互利共生。研究人员比较了所有目前具有全基因组序列的S.symbiotica,发现与非致病性可母系传播的菌系相比,致病性的肠道菌系保留了更大的基因组并且具有更多的与Serratia相关的特异基因(Perreauetal., 2021)。另外,有研究发现,S.symbiotica的分布并不局限于蚜虫中,它还存在于宿主植物和与蚜虫有关的昆虫(蚂蚁、蝽、瓢虫等)中,这些生物可以作为共生菌水平传播的介体(Ponsetal., 2022)。S.symbiotica菌株的复杂性反映出细菌与宿主之间关系的多样化,因此蚜虫共生菌S.symbiotica成为研究昆虫获取细菌后进化的模式(Renozetal., 2021)。

目前,越来越多的证据表明,有些S.symbiotica已经进化为和B.aphidicola共专性存在,它们作为一个整体共同在一些蚜虫种群中起作用,这也解释了为什么在本研究中去除了S.symbiotica后豌豆蚜的生长发育与繁殖都会受到影响。早期有研究发现,向去除B.aphidicola的豌豆蚜注射S.symbiotica能够弥补存活率和繁殖率的降低,使部分蚜虫在失去B.aphidicola后正常存活。并且S.symbiotica能侵入B.aphidicola含菌细胞,建立新的内共生系统,进而取代专性共生菌的位置(Kogaetal., 2003)。在毛蚜Siphamaydis和Periphylluslyropictus中,基因组测序结果表明S.symbiotica与B.aphidicola在合成必需氨基酸与维生素的一些代谢通路上相互补充(Renozetal., 2022)。

Sabri等(2011)从蚜虫体内分离并培养出S.symbiotica,命名为CI-2.3T。本研究中也尝试用同样的方法分离培养,但未成功。我们猜想可能是本实验室豌豆蚜品系中的S.symbiotica基因组大幅减小,与蚜虫在长期协同进化中已经不可分离,难以在培养基上培养。豌豆蚜与S.symbiotica这种相互依存的共生关系,离不开宿主自身对共生菌群的控制和营养物质的统筹分配(Chomickietal., 2020; Whittleetal., 2021)。另外,这种亲密的共生关系意味着宿主会筛选无毒或低毒的菌株,进而导致与侵染性相关的基因的丢失(Perreauetal., 2021)。出现这种亲密共生关系可能是因为当S.symbiotica侵入豌豆蚜体内时,B.aphidicola还未和宿主建立稳定的专性共生关系,在后续的协同进化中,S.symbiotica能够与B.aphidicola共同为宿主提供营养。

本研究发现豌豆蚜品系携带兼性共生菌S.symbiotica,并且能够通过注射氨苄青霉素的方式将其去除。氨苄青霉素并不会影响豌豆蚜体内专性共生菌B.aphidicola的含量,但是去除S.symbiotica后豌豆蚜的生长发育与繁殖都受到了严重影响。这些发现说明S.symbiotica在豌豆蚜体内占据了重要位置,并且它们与豌豆蚜的关系可能处于从兼性共生向专性共生转变的过程中。