抗松针褐斑病湿地松未成熟合子胚胚性愈伤组织的诱导

程 方,孙婷玉,叶建仁*

(1.南京林业大学林草学院,南方现代林业协同创新中心,江苏 南京 210037; 2.广东象头山国家级自然保护区管理局,广东 惠州 516001)

由松针座盘孢菌(Lecanostictaacicola)引发的松针褐斑病严重阻碍了湿地松的推广[1]。自开展湿地松(Pinuselliotii)抗松针褐斑病无性系的组织培养研究工作以来[2-5],以湿地松成熟胚、离体胚无菌苗、无菌实生苗等为外植体,已成功建立其器官发生的组织培养再生体系,并且使试管苗移栽成活[6-7]。相对于器官发生而言,体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高、变异小等优点,是植物规模化、产业化快速繁殖和基因转化再生植株的重要手段,在良种繁育中有着广泛的应用前景[8-9]。目前关于湿地松的体细胞胚胎发生研究已有报道[10-15],但是仍存在胚性愈伤组织诱导率低的问题。影响胚性愈伤组织诱导的主要因素有基因型、培养基种类、激素和培养条件等。不同因素对胚性愈伤组织诱导的效果随不同因素组合及培养材料而不尽相同。为此,本研究以抗病湿地松未成熟合子胚为外植体,探索适宜抗病湿地松体胚诱导的培养条件,进一步提高抗病湿地松优良基因型的胚性愈伤组织诱导率,为湿地松的体胚发生提供更多的精英细胞系,促进抗病湿地松家系组培苗的推广应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

从叶建仁等[4-5]在福建沙县官庄林场建立的抗松针褐斑病湿地松种子园采集9号、8号、34号、2号、23号、39号、11号、25号、10号抗病家系的未成熟合子胚为外植体材料,6—8月采取定点定株分批采集湿地松未成熟球果,确定6月15日、6月22日、6月28日、7月4日、7月13日、7月28日、8月3日等7个球果采收期,每次每株采集6个球果。

1.2 外植体发育阶段检测

随机抽取各湿地松家系球果7个采集时间的合子胚在体视显微镜((Leica MZ16, Wetzlar, Germany)下观察合子胚的发育阶段,参照Pullman等[16]的松属合子胚发育阶段划分标准判断不同家系、采集期合子胚的发育阶段。

1.3 球果采集、家系和冷藏处理

球果采集以9号家系2019年7个采收期的雌配子体为试验材料(其中7月13日采集的球果采用冷藏运输的方式,其余采收期的球果采用邮寄方式),诱导培养基为lobbly pine medium(LP)基本培养基[17],添加2.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1.0 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、15 g/L麦芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、500 mg/L 酸水解酪蛋白(CH)、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,每个处理50个雌配子体,培养21～35 d观察并统计胚性愈伤组织诱导率。

球果家系以7月13日采集的湿地松9号、8号、34号、2号、23号、39号、11号、25号家系为试验材料,将其雌配子体培养在诱导培养基中,每个处理35个雌配子体,培养21～35 d观察统计胚性愈伤诱导率。

冷藏时间以7月13日采集的8号家系为材料,培养在诱导培养基中,设置球果冷藏时间为0、5、15、30、60 d,每个处理32个雌配子体,培养21～35 d观察并统计胚性愈伤诱导率。

1.4 诱导培养基中添加物的处理

糖种类处理以7月4日采集的11号家系为试验材料,诱导培养基为LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES 、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,添加的各种糖质量浓度分别为麦芽糖15、30 g/L,蔗糖15、30 g/L,葡萄糖15、30 g/L,每个处理35个雌配子体,培养21～35 d观察统计胚性愈伤诱导率。

肌醇处理以6月15日采集的10号家系为试验材料,诱导培养基为LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麦芽糖、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,添加的肌醇质量浓度分别为0、100、300、500、1 000 和 2 000 mg/L,每个处理35个雌配子体,培养21～35 d观察统计胚性愈伤诱导率。

抗坏血酸处理以6月28日采集的11号家系为试验材料,诱导培养基为LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麦芽糖、200 mg/L肌醇、500 mg/L CH、250 mg/L MES、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,添加的抗坏血酸质量浓度分别为0、1、2、3 mg/L,每个处理35个雌配子体,培养21～35 d观察统计胚性愈伤诱导率。

a-c.发育早期 early stage; d-f. 发育中期 metaphase; g-i. 发育后期 late stages。图1 湿地松合子胚发育的9个阶段Fig. 1 The nine development process of zygotic embryo of Pinus elliottii

α-酮戊二酸和丙酮酸处理。以7月4日采集的34号家系为试验材料,诱导培养基为LP添加2.2 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L 6-BA、15 g/L麦芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L 谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,添加的α-酮戊二酸和丙酮酸质量浓度组合分别为0 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L 丙酮酸(CK),0 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L 丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和0 mg/L丙酮酸,100 mg/Lα-酮戊二酸和60.7 mg/L丙酮酸,每个处理40个雌配子体,培养21～35 d观察统计胚性愈伤诱导率。

1.5 激素组合

以7月13日采集的9号、8号、34号、2号、23号家系为试验材料,诱导培养基为LP添加15 g/L麦芽糖、200 mg/L肌醇、250 mg/L MES、500 mg/L CH、450 mg/L谷氨酰胺、5.2 g/L琼脂,激素质量浓度分别为2,4-D(2、4、6、8、10 mg/L)、6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ L)和激动素(KT)(0、0.5、1.5、2.5、4.0 mg/ L)3因素5水平全面试验的125个组合,实验编号为Ⅰ-13～Ⅰ-137。每个处理35个雌配子体(每个家系7个雌配子体),培养21～35 d观察并统计胚性愈伤诱导率。

1.6 培养条件及数据统计

所有培养基在灭菌前pH调至5. 8,高温高压蒸汽灭菌(121 ℃,20 min)。所有材料均在(23±1) ℃,暗培养条件诱导胚性愈伤组织。实验结果数据采用Excel 2020整理、分析。

2 结果与分析

2.1 湿地松未成熟合子胚的发育阶段

本研究发现在福建沙县官庄林场采集的湿地松球果的发育阶段大致可分为9个阶段(图1),其中:a—c为合子胚发育早期阶段;d—f为合子胚发育中期阶段;g—i为合子胚发育后期阶段。研究中,6月15日和6月22日两个时间未检测出合子胚形态;6月28日和7月4日合子胚在发育早期阶段;7月13日合子胚由发育早期向发育中期阶段(b—d阶段);7月28日合子胚由发育中期向发育后期阶段(e—h阶段);8月3日合子胚已完全发育至后期阶段(g—i阶段)。

2.2 湿地松诱导的愈伤组织形态分类

根据本实验愈伤组织表面形态和细胞结构将雌配子体诱导的愈伤组织划分为6种类型(图2)。其中,细胞形态为胚性胚柄细胞团结构的愈伤组织在后期产生体胚的概率较高,称之为胚性愈伤组织(图2a—2b);反之,称之为非胚性愈伤组织(图2c—2i),但图2g、2h、2i无法进行增殖培养。因此,本研究统计的出愈率指愈伤组织类型即图2a、2b、2d、2e所占百分比之和。

a.白色、透明、黏性强,细胞形态呈胚性胚柄团状white, hyaline, sticky cells with embryonic germinal stalk clusters;b.丝状、白色、透明、黏性强,细胞显微形态呈胚性胚柄团状的早期原胚,即胚头聚拢,胚柄细胞呈长形细胞状filamentous, white, hyaline, strongly adhesive cells and the clusters performed embryonal suspensor mass in cell microscopic form: embryonal heads clustered, the suspensor cells in the form of elongated cells;c.a—b早期原胚显微观察microscopic observation-early proembryos of a-b.;d.白色、透明、黏性较强,细胞显微形态呈肾形或圆形white, transparent, sticky, with a reniform or rounded cell microscopic form;e.珠孔处1簇愈伤,质地松、软,黏性较强,细胞形态呈肾形细胞female gametophyte with a cluster of callus at the bead hole ejection, soft, more viscous, with a kidney-shaped cell microscopic morphology;f.d—e肾形细胞显微观察microscopic observation-renal cells of d-e.;g.米黄色、黏性,附着在雌配子体表面的极少数愈伤组织female gametophyte cells are beige in colour and surrounded by a sticky substance;h—i.褐化,疙瘩状,无愈伤组织产生female gametophyte browned, lumpy, no healing tissue produced。 图2 湿地松雌配子体诱导的愈伤组织类型Fig. 2 The types of induced callus in P. elliottii

2.3 球果采集时间、家系和冷藏处理时间对湿地松胚性愈伤诱导的影响

研究发现,在7个采收期中,6月28日、7月4日和7月13日球果的出愈率较高(表1),对比发育阶段发现,此时合子胚处在发育早期阶段或由发育早期向发育中期过渡阶段(图1),此时间段之前或之后的出愈率较低,此时间段之前未检测出合子胚形态,此时间段之后合子胚发育至中、后期阶段。因此,笔者认为湿地松合子胚在发育早期阶段对愈伤组织的诱导是有利的,在福建官庄林场采集未成熟湿地松球果进行体胚诱导时间为6月底至7月中上旬最佳。本研究中8个家系的出愈率均较高,其中,23号家系的出愈率最优(85.8%),其次是25号(82.4%)、34号(81.2%)、9号(80.6%)、11号(80.5%)。虽然这几个家系均未获得胚性胚柄细胞团结构的愈伤组织,但这些家系对诱导培养基的响应均较高,在合适的诱导条件下产生胚性愈伤组织的可能性会更高。湿地松球果冷藏5 d,其出愈率最高(80.6%),球果冷藏时间在15天内湿地松出愈率都较高,冷藏60 d的出愈率也能达到68.7%,但Ⅲ型、Ⅳ型愈伤组织能否转化成胚性胚柄细胞团以及其转化率多高还有待进一步观察(表1)。

表1 采集时间、家系和冷藏时间对湿地松愈伤组织诱导率的影响

2.4 不同添加物对湿地松胚性愈伤诱导的影响

在添加的所有种类糖诱导培养基中,30 g/L麦芽糖的出愈率最高(78.6%),其次是添加15 g/L麦芽糖,并且出愈率大小依次为麦芽糖>蔗糖>葡萄糖,可见麦芽糖对湿地松胚性愈伤组织的诱导是有利的,而添加葡萄糖的诱导培养基出愈率最差(表2)。

表2 添加物对湿地松愈伤组织诱导率的影响

表2(续)

出愈率最高的是500 mg/L肌醇的处理,质量浓度1 000 mg/L肌醇是唯一诱导出胚性胚柄结构愈伤组织的处理,当肌醇质量浓度高于1 000 mg/L时,出愈率降低(表2)。说明1 000 mg/L肌醇对湿地松未成熟合子胚胚性愈伤组织的诱导最合适,过高则会抑制其愈伤的诱导。在抗坏血酸质量浓度为0、1、2、3 mg/L时,对湿地松胚性愈伤组织诱导的影响区别不大(表2)。本研究中,α-酮戊二酸和丙酮酸单独添加对愈伤诱导的促进作用较小,而当两者同时添加时明显促进了湿地松愈伤组织的诱导。α-酮戊二酸和丙酮酸同时添加时,湿地松雌配子体的出愈率为85.8%,单独添加α-酮戊二酸或丙酮酸时出愈率分别为75.9%、76.3%,均高于对照处理(表2)。

2.5 不同激素组合对湿地松胚性愈伤诱导的影响

以不同浓度2,4-D、6-BA、KT的125个组合中,结果显示有14个对湿地松愈伤组织诱导产生反应的培养基(表3),其中,Ⅰ-128出愈率最高,达到90.4%,且有早期原胚Ⅰ型愈伤1.8%;另一个产生早期原胚的Ⅱ型愈伤的诱导培养基为Ⅰ-26,其出愈率为78.9%,虽然比其余组合的出愈率低,但是其获得早期原胚型愈伤组织的诱导率最高(2.9%)。另外,111个对湿地松愈伤组织诱导未产生反应的组合不列入表格分析。因此,笔者认为湿地松早期原胚愈伤诱导的较优组合为LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT。

表3 激素配比对湿地松愈伤组织诱导的影响

3 讨 论

从体细胞转变为胚性愈伤组织是一个复杂的过程,受多种因素的影响。本研究对诱导湿地松愈伤组织的影响因素进行了较为全面的探索,涉及影响因素比已有研究更为多样,以抗病湿地松未成熟合子胚为外植体,从外植体采集、保存、基因型、培养基及添加物等胚性愈伤组织诱导的主要影响因素进行全过程的研究,取得了一定的成果,确定了在福建官庄林场采集未成熟湿地松球果进行体胚诱导最佳时间为6月底至7月中上旬即湿地松合子胚发育至2—4阶段时,最利于胚性愈伤组织的诱导。这与胡继文等[14]、张彩云等[15]对湿地松胚性愈伤组织的诱导以及吴静等[18]对抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导研究结果一致。针叶树体胚发生能力与基因型有很大关系[19-20]。本研究发现较易获得愈伤组织的5个基因型为23号、25号、34号、9号和11号家系,孙婷玉等[21]在黑松的研究中也发现将基因型是胚性愈伤组织诱导的关键因素。本研究发现将湿地松球果冷藏5 d时其出愈率最高。唐巍等[12]将湿地松球果在4 ℃冰箱中放置1个月后进行诱导,胚性愈伤诱导率达25.12%;吴丽君[7]发现湿地松球果冷藏5～10 d胚性愈伤组织诱导率最高,冷藏时间延长至20 d以上,愈伤组织诱导率呈下降趋势。诱导的胚性愈伤组织材料必须预先低温(4～8 ℃)储藏,没有低温处理不能启动[22-23],与本研究结果一致。短时间冷藏对提高体胚诱导率有一定的促进作用,这可能由于冷藏运输的低温条件抑制了合子胚的继续发育,也可能由于邮寄的球果在途中受到的刺激,导致活性不如冷藏运输的高。本研究发现添加30 g/L的麦芽糖对湿地松胚性愈伤组织的诱导是有利的。吴丽君[7]在湿地松胚性愈伤诱导时添加15 g/L的麦芽糖,Pullman等[16]诱导火炬松胚性愈伤组织也添加了15 g/L的麦芽糖,而在马尾松和云南松的胚性愈伤组织的诱导实验中均添加30 g/L蔗糖[24-25],这说明不同的松树对糖类的需求存在差异。α-酮戊二酸和丙酮酸同时添加明显促进了湿地松愈伤组织的诱导。肌醇以1 000 mg/L最合适,过高则会抑制湿地松愈伤组织的诱导。抗坏血酸质量浓度为0、1、2、3 mg/L时,对湿地松胚性愈伤组织诱导的影响区别不大。

本研究对影响湿地松胚性愈伤组织诱导的因素进行了全面的研究,筛选出1种较优的湿地松胚性愈伤组织诱导的培养基,即LP+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2.5 mg/L KT,确定了适合湿地松胚性愈伤组织诱导的主要条件,可为提高湿地松胚性愈伤组织诱导率,促进湿地松体胚发生的研究提供依据。