不同抗褐化剂对青钱柳愈伤组织酶活性和生长的影响

王 纪,方升佐

(1.南京晓庄学院,江苏 南京 211171;2.南京林业大学林草学院,江苏 南京 210037)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)又名青钱李、摇钱树等,系胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属,主要分布于安徽、浙江、湖南、四川等亚热带地区[1]。研究发现,青钱柳中富含多酚类、黄酮类和三萜类等生物活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等功效[2-4]。然而,青钱柳因其雌雄异型异熟的特性,导致其种子饱满率低,并且具有深度休眠特性,严重限制了青钱柳的开发和利用[5-6]。而基于组织培养技术的离体快繁技术不仅可以解决种苗供应不足,对突破季节限制组织培养生产次生代谢物质也具有特殊的理论和现实意义[7-8]。但由于青钱柳中含有较高的酚类物质,组培中的褐化问题成为其愈伤组织死亡和制约建立其快速繁殖体系的重要原因。

褐化主要是由于植物组织细胞中的酚类物质氧化形成醌类物质,从而使组织呈现褐色的现象,因此在培养基中添加抗氧化剂抑制酚类物质的合成和氧化成为目前缓解外植体褐化问题的主要措施[9-10]。目前,关于青钱柳组培褐化控制的研究主要集中在外植体的预处理[11]、调整继代时间[12]、添加抗氧化剂[10,13]和激素处理[14]等4个方面。研究表明,添加抗氧化剂和激素在一定程度起到增加愈伤组织的增长量和降低褐化率的效果[15-17]。也有研究表明,外植体的取样部位也是影响褐化的重要因素,木质化程度越高的外植体褐化程度越高,幼嫩的材料褐化率相对较低[18]。然而,有关青钱柳不同部位外植体愈伤组织褐化率、添加吸附剂活性炭(AC)及相关生理指标的研究鲜见报道。因此,本研究以无菌实生苗的不同器官为试验材料,添加具有抗氧化作用的维生素C(VC)、对酚类物质具有专一吸附作用的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和具有无选择性吸附作用的AC作为抗褐化剂,并探究抗褐化剂种类和浓度对青钱柳愈伤组织褐变及其相关代谢酶活性的影响,旨在筛选褐化率低和愈伤组织生长量较高的抗褐化剂种类和最适浓度,为解决青钱柳组织培养过程中愈伤组织的褐化问题提供数据支撑和科学依据,为进一步组织培养生产次生代谢物质和建立快速繁殖体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 无菌实生苗培养材料及培养条件

试验材料为采自江苏省镇江种苗基地(119°32′52″E,30°16′40″N)的青钱柳成熟种子,种子采集后进行去翅、水筛,将沉淀的种子置于4 ℃冰箱内保存。接种前对种子进行消毒处理,先用饱和洗衣粉水冲洗5 min,再在流水下冲洗1 h。冲洗干净后在超净工作台上对种子进行表面灭菌,先用70%(体积分数,下同)酒精浸泡1 min,之后用0.2%(质量分数,下同)HgCl2浸泡20 min,最后用无菌水冲洗8次,用无菌水浸泡封口后置于超净台上过夜。于第2天和第3天在无菌条件下各换1次无菌水,继续浸泡。第4天在无菌条件下换0.1% HgCl2摇动5 min,浸泡过夜。第5天将浸泡后的种子用无菌水冲洗8次后,在超净工作台上进行剥种。取含胚轴和至少1/2子叶完整的胚作为接种试材,以获得无菌实生苗。

无菌实生苗的培养基配方为:WPM+蔗糖 30 g/L+琼脂6 g/L,pH调至5.8,121 ℃高压灭菌20 min,培养温度25 ℃、相对湿度60%、光照时间12 h/d、光照度2 000 lx。

1.2 愈伤组织诱导材料及培养条件

分别取无菌实生苗的完整叶片、根部和茎部的1 cm段作为外植体接入诱导培养基中进行愈伤组织诱导,30 d后将诱导的愈伤组织进行两次继代。

愈伤组织诱导培养基配方为:MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L,pH调至5.8,121 ℃高压灭菌20 min,培养温度25 ℃,相对湿度60%,光照时间12 h/d,光照度1 200 lx。

1.3 抗褐化剂处理

以愈伤组织诱导培养基为基本培养基,分别添加质量浓度为0.1、0.2、0.4和1.0 g/L的VC(分别记为z1、z2、z3、z4),1.0、3.0、5.0 g/L的PVP(分别记为z5、z6、z7)和1.0、2.0、4.0 g/L的活性炭AC(分别记为z8、z9、z10),共10种处理。分别取茎段、叶片和根系经继代培养后外观条件基本一致的愈伤组织作为试验材料,分别接种到经10种处理的培养基上,每种处理3个重复,每个重复10瓶,每瓶接4块愈伤继续培养。

1.4 测定指标方法

1.4.1 愈伤组织鲜质量增长量和褐化率

接种后于10、20、30和40 d统计愈伤组织鲜质量增长量和增长率,于40 d时统计其褐化率。

愈伤组织鲜质量增加量(g/瓶)为每瓶收获鲜质量与每瓶接种鲜质量之差。愈伤组织褐化率为褐化数目占接种数目的百分比。

1.4.2 生理指标的测定

接种后于10、20、30和40 d分别取样,以鲜样进行生理指标的测定。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定采用苯丙氨酸比色法,多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚比色法,过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法[19]。

1.5 统计分析

统计分析使用SPSS 20.0软件,多重比较采用新复极差法(Duncan,α=0.05),图表绘制分别使用Origin 2017和Excel 2016,数据为均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 抗褐化剂对青钱柳愈伤组织褐化的影响

由不同处理下不同外植体愈伤组织的褐化率(表1)可知,不同种类和浓度抗褐化剂对青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织褐化率有显著影响(P< 0.05)。3种外植体愈伤组织褐化率一般随抗褐化剂PVP和AC浓度的升高而逐渐降低,其中叶片为外植体添加PVP抗褐化剂时呈现先降低后升高的趋势。添加VC的3种外植体的愈伤组织褐化率都随着浓度的升高呈现先降低后升高的趋势。与VC和PVP相比,添加AC抑制褐化效果最佳,茎段、叶片和根系愈伤组织在AC质量浓度为4.0 g/L时褐化率最低分别为16.7%、33.3%和26.7%。

由表1还可以看出,不同处理叶片愈伤组织褐化率高于茎段和根系。添加质量浓度为0.1、0.2和0.4 g/L 的VC处理茎段愈伤组织褐化率略高于根系,添加PVP(3.0和5.0 g/L)和AC处理根系愈伤组织褐化率略高于茎段。

2.2 抗褐化剂对青钱柳愈伤组织增长量的影响

不同种类和浓度抗褐化剂处理对青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织增长量均具有显著影响(P< 0.05,表2)。在培养过程中,添加VC、PVP和AC处理的茎段、叶片和根系愈伤组织每10 d的增长量随浓度增加并未呈现一致变化规律,但添加PVP和AC处理愈伤组织累计增长量(0～40 d)随浓度增加呈增加趋势,添加VC处理随浓度增加呈先增加后降低趋势,在0.4 g/L(z3处理)时最高。由表2还可以看出,添加VC和PVP处理不同外植体愈伤组织增长量高于AC处理,且这一差距随培养时间延长而增大。茎段愈伤组织累计增长量在VC质量浓度为0.4 g/L(z3)时最高为6.69 g,在AC质量浓度为2.0 g/L(z9)时最低仅为0.34 g;叶片和根系愈伤组织累计增长量在PVP质量浓度为5.0 g/L(z7)时最高,分别为6.44和5.56 g,在AC质量浓度为1.0 g/L(z8)时最低,分别为0.25 g和0.45 g。

除个别处理外,茎段、叶片和根系愈伤组织增长量随培养时间呈逐渐增加趋势,在30～40 d增长量最高,且不同外植体平均愈伤组织增长量从大 到小依次为:茎段>叶片>根系,茎段愈伤组织质量为3.57 g,分别为叶片和根系的1.17和1.19倍。

2.3 抗褐化剂对青钱柳愈伤组织相关酶活性的影响

2.3.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性

由抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织PAL活性的影响结果(图1a)可知,青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织PAL活性在不同抗褐化剂种类和浓度处理间有显著差异(P<0.05)。添加PVP和VC处理的茎段、叶片和根系愈伤组织PAL活性略高于AC处理。在0～40 d,所有处理不同器官愈伤组织PAL活性均值在叶片中最高为7 526.8 U/(g·h),比茎段和根系分别高出42.3%和21.9%。

由图1还可以看出,愈伤组织PAL活性随抗褐化剂添加浓度的增加整体呈逐渐降低的趋势。在0～40 d,z3、z4、z6和z7处理茎段愈伤组织PAL活性变化相对平稳;z10处理PAL活性显著低于其他处理,而z1和z5处理PAL活性较高(图1a)。除z3处理外,其他处理叶片愈伤组织PAL活性在0～40 d均具有较大变化幅度,z1处理的PAL活性显著高于其他处理(图1b)。根系愈伤组织PAL活性在培养过程中整体呈逐渐降低的趋势;z1处理愈伤组织PAL活性最高,而以z9和z10处理PAL活性最低(图1c)。

2.3.2 多酚氧化酶(PPO)活性

抗褐化剂种类和浓度对青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织PPO活性有显著影响(P< 0.05,图2)。添加PVP处理(z5—z7)的茎段、叶片和根系愈伤组织PPO活性高于添加AC(z8—z10)和VC(z1—z4)处理。在0～40 d,不同处理愈伤组织PPO活性在不同器官中均值从大到小依次为:叶片>茎段>根系,分别为858.1、713.7和705.5 U/(g·min)。

茎段、叶片和根系愈伤组织PPO活性随抗褐化剂添加浓度的增加整体呈先增加后降低的单峰变化趋势。在0～40 d,添加AC处理的茎段愈伤组织PPO活性变化相对平稳,z8处理PPO活性低于其他处理(图2a)。除z2和z4处理外,其他叶片愈伤组织PPO活性在培养过程中均有较大变化幅度,z3和z6处理PPO活性高于其他处理,而z8低于其他处理(图2b)。根系愈伤组织PPO活性在培养过程中均有较大变异幅度,z6和z7处理在第30 d时活性最高,而其他处理均在第30 d活性最低(图2c)。

图2 抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织PPO活性的影响Fig. 2 Effects of anti-browning agents on PPO activity of callus in different organs of C. paliurus

2.3.3 过氧化物酶(POD)活性

抗褐化剂种类和浓度对青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织POD活性有显著影响(P<0.05)。与VC和PVP相比,添加抗褐化剂AC(z8—z10)处理茎段、叶片和根系愈伤组织POD活性较低。在培养阶段,不同处理愈伤组织POD活性在不同器官中均值从大到依次为:叶片>茎段>根系,分别为4 524.0、3 613.6和3051.6 U/(g·min)(图3)。

图3 抗褐化剂对青钱柳不同器官愈伤组织POD活性的影响Fig. 3 Effects of anti-browning agents on POD activity of callus in different organs of C. paliurus

由图3还可看出,不同器官愈伤组织POD活性随抗褐化剂添加浓度的增加与PPO呈一致单峰变化趋势。在培养过程中,不同处理茎段愈伤组织POD活性呈先增加后降低变化趋势,在第20天或30天达到最大值;z3和z6处理POD活性高于其他处理(图3a)。添加AC处理叶片愈伤组织POD活性在培养过程中变化平稳,z2、z3、z5和z7处理在第30天和第 40天远高于第10天和20天;z6处理POD活性显著高于其他处理(图3b)。由图3c可知,在0～40 d,z8和z9处理根系愈伤组织POD活性变化平稳,z2、z5和z6处理变化明显,呈先增加后降低趋势;z8和z10处理POD活性显著低于其他处理。

2.4 相关性分析

相关性分析结果(表3)表明,青钱柳愈伤组织褐化率与PAL活性呈极显著正相关(P<0.01),但与PPO和POD活性相关关系不显著。愈伤组织增长量与PPO和POD活性显著正相关(P<0.05),但与PAL活性相关关系不显著。

表3 青钱柳愈伤组织褐化率、增长量与生物酶 活性指标的相关性分析

3 讨 论

植物组织初代培养、愈伤组织的继代培养过程中经常出现褐化现象,这对离体培养的外植体诱导和生长产生不利影响[7, 20]。在植物组织培养过程中,褐变的底物是酚类化合物,而PAL是酚类化合物合成途径中的关键酶和限速酶[21],因此,PAL与植物组织培养的愈伤组织褐变有密切的关系。谢寅峰等[10]对青钱柳愈伤组织褐化的研究结果表明,青钱柳愈伤组织的PAL活性在不同种类抗褐化剂处理下均受到抑制,并且随着抗褐化剂浓度的增加呈下降趋势。本研究也证实,3种抗褐化剂对青钱柳茎段、叶片和根系的愈伤组织内的PAL活性的抑制效果在不同种类和浓度的抗褐化剂处理间存在显著差异(P< 0.05),且PAL活性均随着抗褐化剂添加量的增加而降低。同时,叶片的愈伤组织PAL活性高于茎段和根系的愈伤组织,这可能是由于青钱柳叶是酚类物质合成的主要部位[22]。另外,添加AC处理的愈伤组织PAL的活性低于PVP和VC处理的,这可能是因为AC的吸附没有选择性,导致了培养基中的营养物质也被吸附,从而造成酚类物质的合成底物减少[23]。

PPO和POD是植物体内普遍存在的氧化酶,在组织培养中将酚类物质氧化成醌类物质,从而引起愈伤组织褐变,因此,PPO和POD活性的高低也是引起愈伤组织褐变的关键[24-25]。本研究结果显示,青钱柳叶片的愈伤组织内PPO和POD活性显著高于茎段和根系愈伤组织的,这可能是因为青钱柳叶的酚类物质含量显著高于根和茎的[22],且PPO和POD活性均与愈伤组织内酚类物质含量呈正相关关系[25-26]。同时,青钱柳茎段、叶片和根系愈伤组织内的PPO和POD活性均随着3种抗褐化剂浓度的增加呈现单峰趋势,这可能是由于过高浓度的抗褐化剂抑制了愈伤组织内的酚类物质的合成。添加PVP处理的愈伤组织PPO和POD活性高于AC和VC处理,这可能是因为AC处理的愈伤组织合成的酚类物质较少,而VC作为一种强抗氧化剂,既能作为醌类物质的还原剂,又能抑制PPO的活性,从而起到抗褐化的作用[27]。

由于不同外植体的酚类物质含量存在差异,因此抗褐化剂种类的选择及其浓度对不同组织的抗褐化能力和愈伤组织增长的影响并不一致[18,27],本研究结果也表明青钱柳茎段、叶片和根系的愈伤组织褐化率和增长量在不同种类和浓度的抗褐化剂的处理间存在差异。此外,研究发现,植物愈伤组织的褐化与相关酶活性密切相关[28]。本研究的相关分析表明,青钱柳愈伤组织褐化率与PAL活性呈极显著正相关(P< 0.01),而愈伤组织增长量与PPO和POD活性显著正相关(P< 0.05)。这说明PAL的活性在青钱柳愈伤组织褐化过程中到关键作用,而愈伤组织增长量受到PPO和POD活性的影响。综合上述PAL、PPO和POD 3种酶的研究结果发现,添加AC的处理对青钱柳愈伤组织褐化抑制效果最好,青钱柳茎段、叶片和根系的愈伤组织褐化率结果也显示添加AC处理的褐化率最低。但是,添加AC处理的茎段、叶片和根系的愈伤组织增长量也是最低的,甚至抑制青钱柳愈伤组织的生长,这与陈雪梅等[26]和冯代弟[29]的研究结果一致,AC是一种无选择性的吸附剂,其在吸附酚类物质的同时也会影响培养基的营养物质的含量,导致生长受阻。同时高浓度的PVP会抑制青钱柳茎段、叶片和根系的愈伤组织增长,可能是因为高浓度的PVP会抑制植物对6-BA等有益物质的吸收利用[30]。而高浓度的VC会增加青钱柳茎段、叶片和根系的愈伤组织褐化率,这可能是因为VC浓度过高时,部分VC会与氨基酸发生反应,增加褐化程度[31-32]。因此,在对青钱柳进行组织培养时,除了选择最适宜抗褐化剂及其最适浓度,还需对青钱柳外植体材料进行选择。

综上所述,不同抗褐化剂及其不同浓度对青钱柳愈伤组织褐化率和生长的影响有所差异,以4.0 g/L的AC处理褐化率最低,以0.4 g/L的VC处理茎段愈伤组织累计增长量最高。进一步探索愈伤组织的褐化率与相关酶活性的关系,PAL酶活性在愈伤组织褐化过程中起到关键作用,可以作为青钱柳组织培养过程中褐化控制的主要参考酶指标,同时外植体器官的类型选择也是控制褐化要考虑的因素。研究结果为青钱柳建立组织培养快速繁殖体系和离体生产次生代谢物质提供了一定的理论基础和技术支撑,但对其次生代谢物质的积累和褐化机理还有待进一步深入研究。