DNA甲基化调控植物组织培养过程的分子机制研究进展

国 颖,杨港归,吴雨涵,何 杰,何玉洁,廖浩然,薛良交

(林木遗传育种全国重点实验室,南方现代林业协同创新中心,江苏省杨树种质创新与品种改良重点实验室, 南京林业大学林草学院,江苏 南京 210037)

植物组织、甚至单个植物细胞都具有强大的脱分化和再分化能力,可以将细胞从分化状态恢复为多能性状态;然后,通过创伤或外源激素诱导重新进入细胞周期,并增殖以建立的芽或根顶端分生组织,最终形成新的器官或植株[1]。基于这种全能性,植物组织培养技术已在快繁与工厂化育苗、细胞培养生产次生代谢产物及基因工程育种等方面得到广泛应用,并在基础生物学、农业、园艺和林业等领域展现出可观的应用前景[2]。然而,对植物细胞如何保持分化状态和发育可塑性的分子调控机制仍知之甚少。

在植物细胞命运重塑过程中,表观遗传修饰的动态变化影响着植株的再生能力。DNA甲基化是一种重要的、进化上保守的表观遗传学标记,调控植物的许多生物学过程。研究表明DNA甲基化通过多种途径调控再生基因的表达,进而在植物组织培养过程中发挥重要作用[3]。笔者综述了DNA甲基化在植物组织培养过程中的调控作用和分子机制,并对通过调节DNA甲基化提高植株再生效率的策略进行展望。

1 DNA甲基化与愈伤组织的诱导形成

1.1 外植体类型对愈伤组织DNA甲基化的影响

DNA甲基化(DNA methylation)通常指在DNA甲基转移酶的催化下,通过共价键结合的方式,获得S-腺苷甲硫氨酸上甲基基团的过程[4]。DNA甲基化主要包括3种类型,即5-甲基胞嘧啶(5-mC)、6-甲基腺嘌呤(6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG),其中5-mC占主要类型。在全基因组背景下,胞嘧啶序列有3种存在形式:CG、CHG(对称型)和CHH(非对称型,H为A、T或C)。植物胞嘧啶甲基化可以发生在所有的胞嘧啶序列中[5],是介导基因转录沉默的一种稳定机制,调控愈伤组织发生和形态建成[6]。

植物愈伤组织是指在组织培养过程中将外植体脱分化所形成的未分化致密细胞结构[7]。在离体培养下,植物细胞会发生大规模的全基因组染色质重塑,从而导致植物DNA序列变异和DNA甲基化水平改变[8]。各种类型外植体产生的愈伤组织(如叶片愈伤组织、茎段愈伤组织等)与相应外植体的DNA甲基化图谱存在差异。对草莓(Fragariavesca)[9]、蓝莓(Vacciniumstenophyllum)[10]和烟草(Nicotianatabacum)[11]叶片组织和叶片愈伤组织的比较研究发现,叶片愈伤组织在全基因组上具有更高的DNA甲基化水平。然而,由毛果杨(Populustrichocarpa)[12]茎段形成的愈伤组织与其外植体茎段组织和再生植株相比,茎段愈伤组织的DNA甲基化水平最低。根据愈伤组织再生能力的不同可将其分为胚性和非胚性愈伤组织[13]。Karim等[14]对凹唇姜(Boesenbergiarotunda)研究发现,再生能力更强的胚性愈伤组织的DNA甲基化水平要低于非胚性愈伤组织,以及再生植株和叶片等其他外植体形成的愈伤组织。不同类型外植体的生理状况和脱分化能力存在差异,因此诱导愈伤组织过程中也伴随着不同DNA甲基化水平介导的转录调控。

1.2 愈伤组织形成阶段中DNA甲基化水平变化

细胞的脱分化过程由遗传和表观遗传机制共同调控,共包括3个阶段:诱导、愈伤组织形成和多能性建立,多种植物在脱分化过程中出现全基因组低甲基化[15-16]。在水稻(Oryzasativa)愈伤组织形成过程中DNA甲基化水平显著降低,DNA甲基化差异区域主要富集在基因启动子周围的序列上[17]。尽管DNA甲基化水平降低是主要趋势,但局部DNA超甲基化对多能细胞状态的形成与维持至关重要。对拟南芥(Arabidopsisthaliana)研究发现,编码丝裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)、谷胱甘肽S-转移酶TAU10(GSTU10)和β-羟化酶1(BXL1)基因的启动子序列在愈伤组织细胞中发生高度甲基化并抑制基因表达,从而促进全能细胞团的形成。MET1和DRM2等DNA甲基转移酶在愈伤组织形成过程中受到广泛的转录控制,这与DNA甲基化水平变化的调控功能相一致[18]。

愈伤组织的分化程度随着组织培养时间的延长而增加,长期培养的愈伤组织中转座子、核糖体DNA和端粒重复序列发生大规模转移和扩增[6],从而导致其DNA甲基化水平不稳定。Ma等[19]对木薯(Manihotesculenta)的茎尖分生组织以及腋芽的松散型胚性愈伤组织进行研究,结果表明随着松散型胚性愈伤组织培养时间的延长,DNA甲基化水平从50%降至27%;而Zeng等[20]的研究表明,白桦(Betulaplatyphylla)早期愈伤组织(诱导后20 d)的DNA甲基化水平最低(11.92%),随着愈伤组织诱导时间的延长,在40 d时DNA甲基化水平升至14.5%。

1.3 愈伤组织中DNA甲基化在全基因组上的变化模式

a. DNA甲基化在基因体中分布模式及其对愈伤组织形成的影响:褐色圆圈代表高甲基化水平抑制基因表达而导致愈伤组织褐化;绿色圆圈代表低甲基化水平促进基因表达进而促进愈伤组织生长the distribution pattern of DNA methylation in gene bodies and its effect on callus formation. Brown circles represent high methylation levels that inhibit gene expression and lead to callus browning, green circles represent a low methylation level that enhance gene expression to promote callus growth;b. DNA甲基化对转座元件表达影响:蓝色矩形颜色由深至浅表示DNA甲基化水平由高至低的变化;灰色矩形颜色由深至浅表示转座子表达由高至低的变化effects of DNA methylation on the expression of transposable elements (TEs).Blue rectangle colors from dark to light indicate changes in DNA methylation levels of TE from high to low, gray rectangle colors from dark to light indicate changes in TE expression from high to low.图1 DNA甲基化动态变化影响愈伤组织生长模式Fig. 1 Dynamic changes of DNA methylation affect callus growth pattern

在全基因组水平上,植物DNA甲基化在不同物种间存在广泛的差异。其中,CG序列甲基化是愈伤组织形成过程中主要的DNA甲基化类型。例如,在草莓[9]、菠萝(Ananascomosus)[21]、葡萄(Vitisvinifera)[22]及拟南芥[23]等植物的研究中均发现其愈伤组织中CG甲基化水平最高(不同物种中占比范围为35%～70%),CHG甲基化位于中间水平(20%～45%),而CHH甲基化水平最低(3%～20%)。对6个菠萝样本的研究表明愈伤组织DNA甲基化在基因区的启动子(上游2 kb)、转录终止子(下游2 kb)、外显子以及内含子等区域变化模式不同[21]。愈伤组织在启动子位点的DNA甲基化变化随着时间增加会出现上升趋势。烟草中的研究表明,愈伤组织培养早期启动子区域的DNA甲基化会出现部分缺失,但在培养阶段后期则发生缓慢的超甲基化[24]。对草莓及菠萝的叶片愈伤组织研究发现,全基因组DNA甲基化水平在内含子(20%～25%)和启动子(25%～33%)区域最高,而在外显子(15%～20%)中DNA甲基化水平较低[9,21](图1a)。此外,对草莓[9]、烟草[11]、菠萝[21]及葡萄[22]等研究都表明愈伤组织中DNA甲基化水平在转录起始位点以及转录终止位点附近比在外显子等区域显著降低。在CG和CHG序列背景下,葡萄的愈伤组织在转座子序列的甲基化率要高于叶片组织的甲基化率,然而在CHH序列背景下愈伤组织的甲基化率则低于叶片组织[22]。拟南芥的愈伤组织和叶片组织之间也具有相似的甲基化变化趋势[23]。当大部分植物中的转座子区域具有整体较高水平的DNA甲基化时,会导致转座子沉默的出现[25],转座子区域的甲基化水平在愈伤组织形成过程中相对稳定(图1b)。

2 DNA甲基化与体细胞胚胎发生

2.1 DNA甲基化参与体胚发生相关基因的表达调控

体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis,SE)是指体细胞或营养细胞在特定诱导条件下再生为胚胎进而具有发育成为独立植株的能力。体细胞可以通过直接途径或历经愈伤组织的间接途径形成体细胞胚,其发生过程涵盖复杂的转录调控机制,其中表观遗传修饰也是影响体胚发生的重要调控方式。研究表明,DNA甲基化能够引起特定参与细胞分化基因的沉默,从而在体胚发生中发挥作用。在对板栗(Castaneamollissima)的研究中发现,MADS-box转录因子家族基因CmAGL11在球状胚胎中特异性积累,与愈伤组织相比,球状体细胞胚胎中CmAGL11启动子处的甲基化水平显著降低。CmAGL11启动子甲基化比率的降低促进了该基因的表达,进而将加快体细胞胚的发育速度[26]。菠萝体细胞胚诱导研究指出,经甲基化抑制剂处理5 d后,体胚发生相关类受体蛋白激酶基因AcSERK1在非胚性愈伤组织中的表达量显著提高,从而有效提高菠萝体细胞胚的发生能力[27]。此外,研究发现在拟南芥中超表达一些体胚发生的关键基因,如LEC(leafy cotyledon)、BBM(baby boom)、WUS(wuschel)等,可以在不添加激素的情况下提高体胚胎发生诱导效率,而DNA甲基化通过影响这些基因的表达进而在一定程度上调控体细胞胚胎的发生[28]。

2.2 体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化水平的变化

体胚发生需要经过脱分化、细胞分裂、再分化等多个步骤,在不同发育阶段DNA甲基化水平也发生变化。油棕(Elaeisguineensis)离体培养前的叶片外植体细胞的细胞核表现出较强的DNA甲基化水平,研究发现随着在高浓度生长素培养基中培养90 d后,叶肉细胞和非反应性维管束细胞中的5-mC免疫荧光信号显著降低[29]。在龙眼(Dimocarpuslongan)胚性愈伤组织、不完全致密的胚前培养物及球状胚中,CG甲基化的全基因组水平远高于CHG和CHH,且在胚性愈伤组织中存在更高水平的DNA甲基化[30]。在棉花(Gossypiumhirsutum)体胚发生去分化过程中也观察到总体mCG水平占比最高,这种趋势在外显子、内含子、转录起始位点上下游2 kb的范围内及其上下游区域都很一致。同时棉花早期体胚发生过程中,CG位点的甲基化水平具有基因型特异性,而CHH位点的甲基化水平具有分化阶段特异性[31]。在对可可(Theobromacacao)的研究中发现,体细胞胚比合子胚具有更高比例的高甲基化CG位点[32]。此外,植物体胚发生过程中还存在DNA甲基化水平早期显著升高后又降低的现象。例如,对椰子(Cocosnucifera)体细胞胚胎发生相关研究发现,DNA甲基化水平在培养第3天迅速升高(10.84%～22.99%),随后在第15天下降至11.69%,在培养第120天后增加至39.63%[33];对龙眼的研究表明,胚性愈伤组织、不完全致密的胚前培养物和球状胚的5-mC含量分别为24.59%、19.65%和19.74%,表明从胚性愈伤组织到不完全致密的胚前培养物的DNA甲基化在全基因组范围内先呈下降,之后略有上升的趋势[31]。

2.3 DNA甲基化调节剂对体胚发生的影响

DNA甲基化修饰是可逆的,当DNA复制过程中甲基转移酶活性偏低时,合成新链中甲基化的胞嘧啶位点未发生甲基化从而造成DNA被动去甲基化;基因组上的5-mC受ROS1(repressor of silencing 1)/DME(demeter)家族蛋白剪切,并由DNA修复系统介导的胞嘧啶修复完成DNA主动去甲基化[34]。DNA去甲基化可以将基因从沉默状态激活,已有证据表明DNA甲基化抑制剂在调控植物体胚发生过程中具有较高的应用潜力。5-氮杂胞苷(5-azaC)作为一种常见的DNA甲基化抑制剂,能够在代谢过程中与DNA甲基转移酶结合以降低酶的活性,进而阻碍DNA甲基化进程并调控体胚发生相关基因的表达。在龙眼体胚发生研究中发现,5-azaC的外源施加降低了胚性愈伤组织的DNA甲基化水平并促进了球状胚的形成。与未经5-azaC处理的龙眼比较发现,处理后的龙眼有关体胚发生的基因表达明显上调,结果表明5-azaC处理对龙眼早期体胚发生具有促进作用[35]。而在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的研究中发现,5-azaC处理诱导的去甲基化终止了胚性细胞系产生体胚的能力[36]。除DNA甲基化抑制剂之外,生长素处理拟南芥能够在一定程度上调节编码ROS1、DML2(dementer-like protein 2)等去甲基化酶的基因[37-38]。此外,研究发现低温诱导[39]、高温诱导、辐射[40],以及铜、银离子处理[41]等都会降低DNA甲基化水平从而提高植物体胚发生的能力。

3 DNA甲基化调控植物再生的分子机制

3.1 DNA甲基化调控植物再生关键基因的表达

组织培养过程中,器官发生主要受WUS、LEC、WOX(wuschel-related homeobox)及WIN(wound-induced)等基因的调控[42-44],研究发现这些基因的表达受到DNA甲基化特异性调控(表1)。

表1 植物组织培养发育过程中DNA甲基化对植物再生关键基因影响

Shemer等[42]对拟南芥根外植体再生能力的研究发现,在野生型拟南芥中WUS启动子的两个CHG位点高度甲基化;而在甲基转移酶基因cmt3的突变体中,CHG甲基化的减少促进了WUS在芽诱导培养基下的表达,这些启动子区域的甲基化变化对WUS基因转录具有关键调节作用[52]。Li等[53]认为,在拟南芥从头芽再生的过程中,WUS基因在甲基转移酶功能缺失突变体(met1)中发生去甲基化,导致WUS基因表达上调。值得注意的是,DNA甲基化对WUS基因的表达调控是发生在芽诱导的早期阶段,同时MET1介导的芽再生受细胞分裂素诱导的细胞周期所调节[54]。Gao等[50]研究发现,黄毛草莓(Fragarianilgerrensis)愈伤组织的诱导过程中有大量基因DNA甲基化水平出现改变,如与伤口反应相关基因WIN、顶端分生组织相关基因WOX、体细胞胚胎形成相关基因AGL(agamous-like)、细胞周期相关基因CDK(cyclin-dependent kinase)和CKX(cytokinin dehydrogenase/oxidase)均发生了去甲基化,表明这些基因的上调表达对愈伤组织的形成至关重要。而在黄毛草莓不定芽诱导阶段,愈伤组织阶段发生去甲基化的基因又重新获得甲基化,如LEC2、与细胞周期进程相关的CKX、生长素活化酶基因ILR1(IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 4)和LEA(late embryogenesis abundant)等基因,表明这些基因的甲基化修饰对于芽的形成至关重要。

3.2 DNA甲基转移酶在植物再生中的作用

植物DNA甲基化维持由胞嘧啶序列环境和DNA甲基化调控酶活性共同决定。DNA甲基化调控酶主要包括甲基转移酶(MET1)、染色质域甲基转移酶(chromomethylase,CMT)、结构域重排甲基转移酶(domains rearranged methyltransferase,DRM)和DNMT3(DNA methyltransferase 3)4个家族[55]。MET1主要维持CG位点的甲基化,CMT3和CMT2主要负责CHG背景下的DNA甲基化,CHH环境中的甲基化由CMT2或DRM2通过RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation,RdDM)途径维持[8]。拟南芥中,MET1依赖的CG甲基化与植株再生有关,与野生型相比,met1-3突变体表现出更高的芽再生能力[46]。DNA甲基转移酶基因在华东黄杉(Pseudotsugagaussenii)体胚发生的不同阶段表达量发生变化,例如CMT、MET1-1和MET1-3的表达量下降,MET1-2的基因表达量大幅增加,而DRM1和DRM2的表达无明显变化[56]。凹唇姜离体培养过程中,MET1、CMT3和DRM2的甲基化水平降低与基因表达水平升高促进了体胚发生和再生[48]。而对龙眼早期体细胞胚胎发生的研究发现,DNA甲基化水平的降低受DNA甲基转移酶基因和DNA去甲基化酶基因ROS1的调控[30]。对更多植物再生体系进行研究,将有助于理解不同DNA甲基化调控酶在再生过程中的调节作用。

3.3 RNA介导的DNA甲基化对植物再生的影响

RNA介导的DNA甲基化(RdDM)是重要的基因调控机制,主要通过双链小RNA(dsRNA)介导相近序列的从头甲基化发挥作用[57]。在植物中,RdDM参与各种生物学过程,如生物和非生物胁迫反应、抑制转座子活性以及再生过程中甲基化模式的形成[7]。在棉花(Gossypiumhirsutum)体胚发生过程中,RdDM通路介导非CG甲基化,并防止基因转录从而影响再生相关基因的表达[56]。而在大豆胚性细胞培养中,RdDM途径是全基因组CHH高甲基化的关键驱动因素。连续多年的组织培养使DNA甲基化减少,导致细胞胚性丧失,从而影响大豆的再生能力[58]。值得注意的是,高活性RdDM的缺失可以解释CHH甲基化的减少,但不会导致CG和CHG甲基化的丢失。

4 展 望

近年来,DNA甲基化在植物组织培养中的研究主要集中在模式植物拟南芥、农作物(水稻、玉米等)和一些园艺植物中,而在林木中的研究相对滞后。通常木本植物具有生长缓慢、寿命长、自交不亲和及高度杂合的特性,其快速再生受到限制,尤其是在气候变化的背景下[59]。过度分泌酚类物质、玻璃化、芽端坏死、生根困难是林木组织培养过程中常见的限制因素[60],阻碍了经济树种的规模化繁殖与遗传改良。在木本植物细胞中,再生相关基因的表达同样受到表观遗传学机制的严格调控。因此,揭示林木细胞的脱分化和再分化过程的DNA甲基化调控机制是提升组培繁殖效率的重要路径,有助于建立更有效的林木再生分子工具。

尽管DNA甲基化调控再生基因表达方面的研究取得了相当大的进展,但二者之间的关联机制还存在争议。一般认为,特定基因座的DNA甲基化水平升高可能通过沉默基因阻碍再生,而全基因组低甲基化通过激活转录而增强再生。例如,在DNA甲基转移酶的功能缺失突变体met1中,WUS调控区的DNA甲基化缺失,导致该基因表达增加以提高芽再生效率[53]。然而,最近研究表明,DNA甲基化也可以与基因转录呈现显著的正相关关系,且DNA甲基化对基因表达的调控既可以是主动的,也可以是被动的[61]。识别不同激素环境下以及不同再生阶段的植物细胞中DNA甲基化与基因表达之间复杂的调控关系,将进一步加深对植物再生过程中表观遗传调控作用的理解。

基于前期研究结果,DNA甲基化在植物组培中的研究可集中在以下4个方面:①加强组织培养过程中DNA甲基化与多组学的关联研究,结合单细胞测序等多维组学技术,精确解析再生调节基因的表观遗传调控机制;②开发多种甲基化抑制剂,通过定向调控甲基化酶活性,以引起组织培养过程中的去甲基化和再生相关基因的再激活;③深入解析生长素和细胞分裂素在细胞重编程过程中对甲基化水平的调控机制,为提高组培再生效率提供潜在的靶点;④应用CRISPR/dCas9靶向去甲基化技术,对再生调节基因的甲基化水平进行设计改造,全面提高植物再生效率,并为提高顽抗树种的再生能力提供技术支撑。