不同生长调节剂对‘新球蜜荔’体胚发生的影响及其组织学观察①

王 果 李焕苓 王树军 孙进华 李 芳 王家保

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部儋州农业环境科学观测试验站 海南海口571737)

荔枝（Litchi chinensisSonn.）属无患子科荔枝属常绿乔木，是我国南方重要的经济果树之一［1］。产业中的病危害严重、采后损失较大、成花不稳等问题迫切需要优良品种。传统的育种效率已经难以满足目前市场的需求，生物技术育种时效高成为当前植物品种改良的主要手段，已经成功应用于香蕉［2］、番木瓜［3］、番茄［4］、苜蓿［5］、水稻［6］、苹果［7］等植物品种改良中。建立高效稳定离体再生技术体系是植物生物技术育种的基石，体胚发生是建立木本植物离体再生的主要途径。体胚具有两极性结构，可以直接形成再生植株，在无性繁殖上具有较大优越性［8］。开展荔枝体胚发生研究，对于植物基因工程、细胞工程、杂交育种、良种快繁、转基因受体和突变体筛选等具有重大价值，同时有助于研究细胞离体培养中形态发生、细胞分化与胚胎发生等重大理论问题。

荔枝品种不同，其离体再生体系建立难易不同，体胚高频发生是建立荔枝离体再生技术体系的基础。目前仅有15 个荔枝品种获得再生苗［9］，其离体再生体系不稳定，再生率较低，最基本的原因在于未能建立高频稳定的体胚发生体系从而获得大量体胚。‘新球蜜荔’是海南原产的优异荔枝资源品种，果实外观好，风味佳，产量好；生长量小，栽培管理不复杂，建立‘新球蜜荔’离体再生技术体系，可为加快其在育种上的改良及生产推广应用提供理论基础。本研究拟以‘新球蜜荔’花药为外植体获得的胚性愈伤组织为材料，研究不同生长调节剂对‘新球蜜荔’体胚诱导的影响，建立体胚成熟及萌发体系，同时对体胚发生过程中的组织形态学观察，揭示荔枝体胚发生和发育过程，为果树体胚发生研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘新球蜜荔’花药诱导保持所获胚性愈伤组织为材料，比较不同生长调节剂对‘新球蜜荔’体胚高频发生的影响。

1.2 方法

1.2.1 体胚发生

将继代保持18 d 旺盛生长的‘新球蜜荔’胚性愈伤组织接种到添加不同生长调节剂的MS 培养基上（表1）诱导体胚发生。每瓶接种约0.1 g，每个处理各接种10 瓶；接种后置于（25±2）℃环境中黑暗培养；以10瓶为一重复，实验独立进行3次；约7 周时统计体胚个数，以直径≥0.3 cm 的体胚为准。

1.2.2 体胚成熟

参考王果［20］，体胚形态多样，有双子叶胚、团状胚、喇叭胚等9种形态，依据其颜色可分为乳白胚和透明胚，乳白胚即体胚乳白色，经过成熟后有进一步萌发的潜力。透明胚为淡黄色透明胚，在成熟过程中逐渐褐变死亡，不能萌发。

将诱导53 d、直径≥0.3 cm 的‘新球蜜荔’乳白胚与透明胚分别转接到不同浓度ABA 与PEG-600组合的成熟培养基上，每处理约接种30 个，实验独立进行2 次；约65 d 时观察并记录体胚成熟情况。

1.2.3 体胚萌发

将‘新球蜜荔’成熟胚转接到萌发培养基上，对比不同成熟培养基上成熟体胚的萌发效果。每瓶接种约4个体胚，每个处理各接种20瓶；约30 d统计体胚萌发量，观察并记录体胚萌发过程。

1.2.4 愈伤组织形态学观察

取‘新球蜜荔’T3、T7、T11 体胚培养基上培养3、6、9、12、15、18、21、24、27 d 培养物进行组织形态学观察。

2 结果与分析

2.1 NAA对体胚发生的影响

NAA 0.1 mg/L与KT 5 mg/L组合中，‘新球蜜荔’体胚发生率、发生数量、乳白胚比例都较未添加NAA 培养基上的明显降低。分别添加NAA 0.1 mg/L与ZT 5 mg/L、TDZ 0.5 mg/L 的两个组合中，‘新球蜜荔’体胚发生率、发生数量、乳白胚比例都比未添加NAA的高。

2.2 不同生长调节剂组合对3 个荔枝品种体胚发生的影响

从图1 与表1 可以看出，不同种类、不同浓度的生长调节剂（ZT、KT、TDZ）对‘新球蜜荔’体胚发生影响不同。影响较大的是TDZ，其次依次是ZT 与KT；其中添加TDZ 的培养基体胚发生率达100%，体胚发生数量最多，为6 010 个/g FW；添加ZT 的培养基体胚发生率均为100%，体胚数量最多达5 540 个/g FW；添加KT 的培养基体胚发生率最高只有90%，体胚数量为4 110 个/g FW。添加一定浓度ZT、KT 组合的培养基均发生体胚，数量最高达5 690个/g FW。

不同种类、不同浓度生长调节剂对‘新球蜜荔’体胚发生数量质量影响都不同。添加TDZ 0.5 mg/L 培养基上体胚发生数量最多，达6 010 个/g FW，乳白色体胚占93.29%，多为球形胚与细长子叶胚，直径多在0.3～0.7 cm，有部分乳管胚直径达1.7 cm；TDZ 浓度升高或降低，其体胚数量都急剧减少，且透明胚比例升高，在TDZ 0.1 mg/L时全部是透明胚。在添加不同浓度ZT 的培养基上，以添加5 mg/L ZT 培养基上的白色体胚发生率最高，乳白色体胚多为球形，不黏连，一碰即落，不似TDZ 中的球形胚成块；体胚整体在0.3～0.6 cm，体积较TDZ、KT 培养基上的大小均一，无明显差距；体胚数量较TDZ 0.5 mg/L培养基上的体胚数量少，随着TDZ 浓度升高或降低，其体胚数量都减少，分化大量透明胚，透明胚体积相对较大。在添加不同浓度KT的培养基上，体胚发生数量较少，最高仅4 110个/g FW；乳白色体胚比例也较低，为1.95%；随着KT浓度升高，其体胚发生率与白色体胚比例也增大，添加7 mg/L KT，体胚发生数量达3 810 个/g FW，没有仅添加5 mg/LKT 培养基上的体胚数量多，但是乳白色体胚比例较其微高；添加KT 培养基上的胚性愈伤组织全部褐变。添加ZT 3 mg/L 与KT 2 mg/L 组合的培养基上体胚发生数量达5 690 个/g FW，乳白色体胚占89.7%；该培养基上体胚全分化，透明胚相对大，0.4 cm以上；且还分化较多0.1 cm 球形、小乳白胚；子叶胚弯曲，0.3 cm 且渐成熟转绿。但同时添加ZT2 mg/L、KT 3 mg/L 培养基上的体胚则较多分化透明胚，体积形态不规则，可分化至子叶胚，球形胚较少。

由此可见，过高或过低生长调节剂对荔枝体胚发生都是不利的。确定‘新球蜜荔’体胚高频发生的适宜培养基为添加TDZ 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L的MS培养基。

表1 不同生长调节剂对‘新球蜜荔’体胚发生的影响

2.3 ABA 及PEG 不同浓度组合对体胚成熟及萌发的影响

2.3.1 对体胚成熟的影响

无论是否添加ABA，体胚褐死率都随着PEG-600浓度升高出现先降低后升高；而当无添加PEG-600 时，褐死率随着ABA 浓度升高出现先升后降，最低达42.22%；当ABA 浓度为1 mg/L 时，褐死率明显上升；当ABA浓度为2 mg/L 时，褐死率微降后升。因此，仅添加PEG-600 或1 mg/L ABA 都能明显降低体胚褐死率，但同时添加两者其褐死率反而较单独添加的高；不过，高浓度的ABA（2 mg/L）与高浓度PEG-600（50 g/L）组合其褐死率反而降低，接近单独添加PEG-600的褐死率。

PEG-600 通过提高培养基渗透势对体胚含水量起作用，而ABA 能改善体胚质量，添加了ABA 的培养基处理乳白色体胚都较鲜白，饱满。因此选择PEG-600 25 g/L 促进体胚成熟，在体胚的特定或某一阶段选择1 mg/L ABA来调控体胚状态。在上述不同体胚成熟培养基上，透明胚逐渐褐变死亡，个别乳白胚褐变（表2）。

表2 不同浓度ABA及PEG组合对‘新球蜜荔’体胚成熟的影响

2.3.2 对体胚萌发的影响

不同来源成熟体胚在萌发培养基上表现不同。来源于有添加PEG-600的成熟体胚褐死较多。当无PEG-600存在时，添加1 g/L ABA培养基上的体胚褐死最少；添加不同浓度PEG-600 后，ABA 对体胚褐死影响不是很大；而同时添加高浓度PEG-600 及ABA 后，体胚大多褐变；因此体胚成熟时单独添加ABA对体胚萌发有促进作用。

无添加ABA 时，低浓度PEG-600（25 g/L）对体胚萌发有抑制作用，随着浓度升高，体胚较少褐变；而当添加ABA 后，随着PEG-600 浓度升高，其褐变程度加大。因此体胚成熟时单独添加PEG-600对体胚萌发有促进作用。

体胚萌发过程中全部变绿，仅有一个体胚抽出茎段，但无真叶展开。个别乳白胚再生出鲜乳白色次生胚，体积较小，约0.5～0.8 cm，该种体胚在光下不能变绿；透明胚在萌发过程中逐渐褐死。在萌发培养基上有少数类似于茎、芽，或弯曲或泡状化的畸形结构，有1 个体胚有不定根生成。

2.4 ‘新球蜜荔’体胚发生过程中的组织形态学变化

‘新球蜜荔’胚性愈伤组织细胞有椭圆形与圆形，细胞紧凑，内含物丰富，可见细胞质、细胞核及淀粉粒（图1 b 红色箭头所指）。胚性愈伤组织中夹杂非胚性细胞，非胚性细胞体积较大，细胞核质比低，在体胚分化过程中逐渐裂解凋亡。胚性愈伤组织内部或者表面可见大小不一的单个或两个以上相对孤立的胚性细胞或胚性细胞团，由此可推测胚性细胞可能起源于单个细胞，但不排除多个细胞的体胚发生方式；体胚发生的起源方式则同时有外起源（图1 b 黄色箭头所指）和内起源（图1b 红色、紫色箭头所指）两种。

胚性细胞体积小，核大，细胞质稠密，染色深，经过对称分裂形成胚性细胞团。随着培养时间延长，胚性细胞团形成明显凸起或长条形原胚（图1b 黄色箭头所指），经过不对称分裂，原胚表现出极强烈的极性，胚顶端下凹两边凸起形成子叶原基，分化为心形胚；子叶原基接着分裂分化，子叶伸长，发育成为鱼雷形胚。鱼雷形胚子叶继续伸长，根冠细胞裂解（图2 KT-18 d），形成具有明显顶端分生组织、原形成层带、发育良好的子叶和根的子叶胚。体胚在形成过程中或与愈伤组织紧密相连，或在不同发育阶段时从愈伤组织中游离开来，有的体胚则互相黏连，而形成连体胚（图2TDZ-12 d）。

在不同体胚发生培养基上，体胚发生时间不一致。ZT、TDZ 培养基上的愈伤组织在初期（ZT-3 d，TDZ-3 d）已经有原胚发生，ZT 培养基上，至9 d 时有多个原胚，12 d 时有心形胚及子叶胚出现，且12～15 d间出现大量心形胚及子叶胚；21～24 d主要是球形胚与鱼雷形胚，至24 d 时多子叶胚居多。TDZ 体胚发生培养基上，12 d 时发现心形胚，15 d 时有大量心形胚出现，21 与24 d 出现大量的鱼雷形胚及子叶胚，此时间是体胚开始大量形成子叶胚的阶段。

KT 体胚发生培养基上，9 d 天时才隐约可见球形胚（图2 KT-9 d），12 d 时球形胚大量发生，15～18 d时主要是球形胚及心形胚发生，21 d有子叶 胚出现，24 d子叶胚增多。

3 讨论

3.1 不同生长调节剂种类及水平对体胚诱导的影响

除基因型外，激素种类及水平是影响植物离体再生的主要因素。KT、ZT 是果树体胚发生最常用的植物生长调节剂，使用浓度范围较大，在0.25～5 mg/L。橡胶［21］、荔枝［22］及芒果［23］等果树上使用的KT 浓度较高，分别为1、3、5 mg/L，从而获得大量体胚。杂交鹅掌楸［24］采用富含0.5 mg/L KT 或ZT 4 mg/L 获得大量原胚。TDZ 常用于顽拗性植物体胚发生，其作用较强，使用浓度范围较低。红姜花［25］采用0.15 mg/L TDZ 诱导体胚，体胚诱导率高达4500 个/mL；当TDZ 为0.003 mg/L时，杉木［26］体胚诱导率最高；尾巨桉［27］胚性愈伤组织在附加NAA 0.1 mg/L 与TDZ 0.1 mg/L 的MS 培养基上得到体胚。本试验通过添加NAA与不同浓度的细胞分裂素（KT、ZT、TDZ）对‘新球蜜荔’胚性愈伤组织体胚发生影响的比较发现，NAA、KT、ZT、TDZ对体胚发生均有作用，在添加TDZ 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L MS 培养基上，体胚发生数量达6 010个/g FW。随着激素浓度降低或升高，体胚发生数量都降低。适宜浓度KT、ZT组合对‘新球蜜荔’体胚发生相对也较好，体胚发生数量达5 690 个/g FW。

3.2 体胚成熟及萌发

ABA 是促进体胚成熟最有效的植物生长调节剂，常与渗透剂PEG用于促进体胚成熟。几乎所有针叶树都采用ABA 及PEG 组合来促进体胚成熟［28］，其组合ABA常用浓度为10～50 mg/L，PEG常用PEG-8000，使用浓度范围较大，从20～200 g/L。在培养基中添加0.5 g/L ABA 及PEG 可显著提高栓皮栎体胚成熟［32］。香榧体胚成熟处理中PEG-6000 40～80 g/L、ABA10 mg/L 比 较 适 合 体 胚 成 熟［33］。在‘新球蜜荔’体胚成熟过程中，25 g/LPEG-600有一定促进作用，ABA 1 mg/L 能改善体胚质量。体胚萌发时，仅有一个体胚抽出茎段。因对成熟体胚形态并无统一标准，均以成熟体胚具有较高萌发率作为判断体胚是否发育成熟的依据，很多研报道提出了可以促进体胚成熟发育的因素但缺乏对其促进机理的研究，因此探明体胚发生机理才能突破体胚成熟发育不完全，萌发低的瓶颈。

3.3 体胚发生过程中的组织形态学变化

植物体胚发生重演合子胚发生途径，但体胚发生部位及发生方式随植物种类及生长调节剂作用而异，大部分植物体胚发生都是单细胞起源。王天地［34］研究发现，橡胶体胚发生部位同时存在于愈伤组织表层及愈伤组织内部的单个胚性细胞；Shirin［35］研究发现，疏花火烧兰早期体胚起源于愈伤组织表层多个细胞团结构；Shen［36］发现，万年青体胚来源于愈伤组织表层的单个胚性细胞。荔枝体胚发生过程中的组织形态学变化已有研究报道。邓朝军［14］指出，三月红荔枝体胚发生与合子胚发生途径一致；吉训志［37］对比了2 个荔枝品种不同荔枝品种体胚发生初期愈伤组织的形态变化，指出愈伤组织形态不同，其体胚发生能力不同。王果［20］指出，‘妃子笑’荔枝愈伤组织形态不一，其体胚发生起源于愈伤组织内部单个胚性细胞，重演合子胚发生过程。本研究发现，‘新球蜜荔’体胚发生部位既有内部又有外部两个部位，都是单细胞起源。通过调整胚性愈伤组织状态来改善‘新球蜜荔’体胚形态多样且高度不同步化，体胚与愈伤组织黏连或其游离时间早晚与体胚成团是否存在关系等有待于进一步研究。