基于UPLC-Q-TOF/MS2联用技术的菖蒲属中药7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮类成分的分析

李 娟,黄玉婷,段 彦,马 源,杨紫怡,严建业,李顺祥*

1湖南中医药大学;2湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心;3湖南省中美老年性退行性疾病治疗药物国际联合研究中心,长沙 410208

APG IV系统是由被子植物系统发育研究组(angiosperm phylogeny group,APG)建立的被子植物分类系统的第四版,该分类系统认为菖蒲目(Acorales)属于中生被子植物中的单子叶植物分支,是单子叶植物的最基部类群,Acorales下仅有一科(菖蒲科Acoraceae)一属(菖蒲属Acorus),常见植物有菖蒲(AcoruscalamusL.)和石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)[1]。2020版《中国药典》收载的菖蒲属药材有石菖蒲(Acori Tatarinowii Rhizome)和藏菖蒲(Acori Calami Rhizome)[2],藏菖蒲是因藏药习用而得名,其基原植物分别为石菖蒲(A.tatarinowiiSchott)和菖蒲(A.calamusL.)。现代药学研究证明,菖蒲属中药具有较好的改善学习记忆和认知能力的作用[3-6]。近年来,除挥发油、β-细辛醚、倍半萜等活性较明显的成分外[7-9],还从菖蒲属中药中发现了活性较好的生物碱类成分,Lao等[10]从石菖蒲中分离得到菖蒲碱甲(tatarine A)、菖蒲碱乙和菖蒲碱丙,其中,含此3个成分的石菖蒲乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物能显著改善东莨菪碱所致记忆障碍模型小鼠的记忆障碍;Li等[11]从菖蒲中分离得到菖蒲碱甲和菖蒲新碱(neo-tatarine),这两个生物碱对受损神经细胞具有良好的保护作用。

菖蒲新碱是一种结构新颖的环庚三烯酮异喹啉生物碱(tropoloisoquinoline alkaloid,简称TA),化学名6-羟基-5,8-二甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮(6-hydroxy-5,8-dimethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one),其基本母核为7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮(7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one,简称7H-AI7O,骨架见图1)[11],菖蒲新碱是目前从自然界中发现的唯一具有7H-AI7O结构母核的化合物,但菖蒲新碱在植物中的量极少,从10 kg植物菖蒲的干燥根茎中仅分离得到5 mg。因此,鉴于7H-AI7O类成分的结构特点和生物活性,本文以菖蒲新碱为对照品,以7H-AI7O类成分为监测对象,采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS2)联用技术,快速监测和鉴定菖蒲属中药7H-AI7O类成分的组成和分布,为进一步丰富该类成分的植物来源和相关药物的研发,提供一定的实验依据。

图1 7H-AI7O的结构骨架Fig.1 Structural skeleton of 7H-AI7O

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2020年和2021年的11月份在西藏、安徽、湖南等地,共采集10批菖蒲属植物(见表1),由湖南中医药大学王智副教授鉴定为菖蒲科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott和菖蒲AcoruscalamusL.,取石菖蒲和菖蒲根茎,除去须根和泥沙,洗净,阴干,得到石菖蒲和藏菖蒲药材。标本保存于湖南中医药大学湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心。

表1 菖蒲属药材的采集信息

试剂:薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工集团公司),柱色谱硅胶(300～400目,青岛海洋化工集团公司),乙醇、甲醇、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、丙酮和硫酸等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司);Xevo G2-XS Q-TOF/MS四级杆飞行时间质谱仪(美国Waters公司);BSA 124S-CW分析天平(深圳市华恒仪器有限公司);Heraeus Pico 17高速离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 石菖蒲和藏菖蒲药材中7H-AI7O类成分的富集

菖蒲属药材干品粉碎成粗粉,取100 g置2000 mL圆底烧瓶中,加乙醇回流提取2次,每次提取1.5 h,加10倍药材量溶剂,过滤,合并提取液,50 ℃减压浓缩至无醇味,提取物继续加水50 mL使悬浮,转移至分液漏斗,依次用石油醚(60～90 ℃)和乙酸乙酯萃取5次,每次100 mL,合并乙酸乙酯萃取液,50℃减压浓缩至干,加适量乙醇溶解,上硅胶柱色谱(Φ 3.0 cm × 50.0 cm)分离,依次用不同梯度的石油醚-丙酮(6∶1,3∶1和1∶1)和甲醇洗脱,每个梯度的溶剂用量为2倍柱体积,流速3 mL/min,洗脱液接样50 mL/瓶,以菖蒲新碱为对照品,采用薄层层析法(TLC),吸取各洗脱样品20 μL,分别点于硅胶G薄层板上,以石油醚-丙酮(5∶4)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检识,与菖蒲新碱对照品斑点比较,确定各批次含7H-AI7O类成分的洗脱馏分并合并,50 ℃减压浓缩至干,即得菖蒲属中药7H-AI7O类成分的富集部位。

1.3.2 菖蒲新碱对照品溶液的制备

精密称取菖蒲新碱2.0 mg,置10mL容量瓶,加三氯甲烷-甲醇(1∶1)溶解并稀释至刻度,摇匀,精密移取1 mL置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得,作为TLC用对照品溶液。取TLC用对照品溶液,加甲醇稀释制成浓度为20 ng/mL,离心(5 000 r/min)5 min,取上清液,作为UPLC-Q-TOF/MS2检测用对照品溶液。

1.3.3 UPLC-Q-TOF/MS2检测用供试品溶液的制备

称取“1.3.1”制备的不同产地菖蒲属中药7H-AI7O类成分的富集部位各5 mg,加甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中,摇匀,离心(5 000 r/min)5 min,取上清液,备用。

1.3.4 UPLC-Q-TOF/MS2的检测方法

液相色谱条件:ACQUITY UPLC-BEH C18色谱柱(2.1 mm × 50 mm,1.7 μm),流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),洗脱程序0～3 min,10%→15% B;3～20 min,15%→30% B;20～40 min,30%→55% B;40～55 min,55%→80% B;55～60 min,80%→10% B,流速0.3 mL/min,柱温30 ℃,进样量1 μL。

质谱条件:应用电喷雾正离子模式进行检测,扫描方式为MRE扫描,使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix(G1969-8500)对准确质量数进行矫正。一级全扫质量扫描范围为m/z100～1 200,分辨率为30 000,除溶剂气体为氮气;干燥气流速为6.8 L/min;毛细管电压为4.0 kV;Fragment电压为110 V;鞘气温度为350 ℃;二级质谱使用依赖性扫描,在一级扫描基础之上选择前三强进行诱导碰撞解离获取其二级质谱数据。

1.3.5 数据分析

以菖蒲新碱的一级和二级质谱裂解途径为参比,结合目标生物碱保留时间、一级和二级质谱裂解信息,比较分析不同产地石菖蒲和藏菖蒲药材中存在的7H-AI7O类成分。

2 实验结果

2.1 菖蒲属中药7H-AI7O类成分富集部位的确定

菖蒲属中药中7H-AI7O类成分含量较低,分析前需富集7H-AI7O类成分获得富集部位。不同批次石菖蒲和藏菖蒲药材经溶剂提取、溶剂萃取和硅胶柱色谱分离,以菖蒲新碱为对照,经TLC定性分析,仅在藏菖蒲S2批、S4批和S5批,石菖蒲S6批的洗脱馏分中检测到7H-AI7O类成分(TLC色谱图中呈深红色班点),分别将这4批药材中具有红色斑点的洗脱馏分合并,S2批合并1～45馏分、S4批合并11～38馏分、S5批合并9～19馏份、S6批合并13～18馏分,再进行UPLC-Q-TOF/MS2检测和分析。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS2检测结果

2.2.1 菖蒲新碱对照品的质谱裂解途径分析

UPLC-Q-TOF/MS2监测菖蒲属中药中7H-AI7O类成分,采用正离子模式,一级质谱和二级质谱可清晰观察到7H-AI7O类成分的准分子离子峰和相关碎片峰,而负离子模式下基本不能观察到相关裂解的碎片峰。

正离子模式下,菖蒲新碱的准分子离子峰为[M+H]+m/z308.092 6,根据二级质谱(见图2B),推测其裂解途径为m/z308.092 6先丢失1分子CO生成m/z280.097 1碎片离子,碎片m/z280.097 1的8位甲氧基和6位羟基依次丢失CH3和H自由基产生m/z265.072 5和264.065 9的碎片离子,碎片264.065 9继续丢失1个CO分子得到m/z236.071 0碎片离子。根据裂解途径分析,7H-AI7O母核C-7位易丢失一个中性CO分子,再在C-8位甲氧基丢失1个CH3自由基,C-6位羟基丢失1个H自由基,结构发生电子重排,生成C-6和C-7位羰基取代的荧蒽生物碱(azafluoranthene alkaloid,AA)结构,继续丢失一个CO分子,详见质谱裂解途径(见图2C)。

图2 正离子模式下菖蒲新碱的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)和可能的裂解途径(C)Fig.2 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of neo-tatarine in positive ion mode

2.2.2 不同产地菖蒲属中药7H-AI7O类成分的分析

根据菖蒲新碱对照品的一级质谱和二级质谱的裂解途径比对和目标化合物裂解规律分析,藏菖蒲S2批、S4批和S5批和石菖蒲S6批检测的7H-AI7O类成分的富集部位中,产自湖南浏阳市大围山的S2批藏菖蒲中检测到4种结构取代基类型,分析出5个具有7H-AI7O结构的化合物,产自安徽省六安市霍山县的S4批藏菖蒲中检测到2种结构取代基类型,分析出2个具有7H-AI7O结构的化合物,其余产自西藏林芝市察隅县的S5批藏菖蒲和产自湖南浏阳市大围山的S6批石菖蒲,都只检测到菖蒲新碱。本实验结合化合物取代基种类和极性,以藏菖蒲S2批中除菖蒲新碱外的4个7H-AI7O类化合物为例,分析菖蒲属中药中7H-AI7O类成分的结构,详见4批样本的总离子流图(total ion chromatogram,TIC)(见图3)和母离子及主要碎片离子信息(见表2)。

表2 S2、S4、S5和S6批菖蒲属中药中7H-AI7O类成分的母离子及主要碎片离子

图3 正离子模式下S2、S4、S5和S6批药材7H-AI7O类成分富集部位的总离子流图Fig.3 TIC of the enriched sites of 7H-AI7O components in batches S2,S4,S5,and S6 of medicinal materials in positive ion mode

依据菖蒲新碱裂解规律,并结合TA与AA天然产物的结构分析[10],7H-AI7O结构母核上通常有OH、OCH3和COOH等取代基,并以OH、OCH3取代为主,基本未发现烷烃基直接取代的情况。

5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的准分子离子峰为[M+H]+m/z322.107 8,根据二级质谱(见图4B),推测母离子m/z322.107 8先丢失1个CO分子得到m/z294.112 2碎片离子,再依次丢失3个CH2O得到m/z204.079 7碎片离子;同时,m/z294.112 2碎片离子也可依次丢失2个CH3自由基,经电子重排,得到m/z264.065 2碎片离子,再继续丢失1分子CO。从裂解途径分析,该化合物的结构中应该有3个OCH3取代基,且在6和8位有OCH3取代,详见质谱裂解途径(见图4C)。

图4 正离子模式下5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)和可能的裂解途径(C)Fig.4 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry(B),and possible fragmentation pathways(C) of 5,6,8-trimethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的准分子离子峰为[M+H]+m/z336.123 7,根据二级质谱(见图5B)分析,母离子m/z336.123 7丢失1个CO和1个C2H4得到m/z280.097 0碎片离子,m/z280.097 0离子同菖蒲新碱,依次丢失CH3和H自由基产生m/z264.065 9碎片离子,再继续丢失1个CO生成m/z236.070 9碎片离子。根据裂解途径分析,该化合物结构中存在1个OCH2CH3和2个OCH3取代基,初步确定6位和8位为OCH2CH3和OCH3取代,另1个OCH3可能在除6、7和8位的其他位置取代,详见质谱裂解途径(见图5C)。

图5 正离子模式下5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)和可能的裂解途径(C)Fig.5 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of 5,8-dimethyl-6-ethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的准分子离子峰为[M+H]+m/z336.123 3,根据二级质谱(见图6B),推测其裂解途径为,母离子m/z336.123 3丢失1个CO和1个C2H4,得到m/z280.097 4碎片离子,m/z280.097 4离子再依次丢失1个CH3、1个H自由基和1个CO生成m/z236.070 9碎片离子。根据裂解途径分析结构中有2个OCH3和1个OCH2CH3取代基,取代基类型同5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮,但从离子流图分析,5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的tR值17.11 min,5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的tR值17.74 min,说明这两个化合物的极性有差异,其极性差异与取代基位置直接相关,初步推测这两个化合物的极性差异与6位是否有OCH2CH3取代有关,当6位有OCH2CH3取代时,与7位羰基产生空间位阻,一定程度上,影响7H-AI7O的刚性平面,使化合物极性增大;当6位无OCH2CH3取代时,不与7位羰基产生空间位阻,化合物极性相对前者较小,而OCH2CH3取代基位置可能在4、5、9、10或11位,详见质谱裂解途径(见图6C)。

图6 正离子模式下5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)和可能的裂解途径(C)Fig.6 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of 5,8-dimethyl-9-ethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

以5-乙氧基-6-羟基-8-甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮为例说明,该化合物的准分子离子峰为[M+H]+m/z322.107 7,根据二级质谱(见图7B),推测裂解途径为母离子m/z322.107 7分别丢失1个CO分子、1个C2H4生成m/z266.081 3碎片离子,再失去1个CH3自由基和1个CO,生成m/z223.062 1碎片离子,分析结构中存在1个OCH2CH3、1个OCH3和1个OH取代基;当6位有OCH3或OCH2CH3取代时,与7位羰基产生空间位阻,化合物极性增大,但与5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮和菖蒲新碱的结构和极性比较分析,该化合物的极性较小,推测6位无OCH3或OCH2CH3取代,可能有OH取代,当6位是OH取代时,与7位羰基形成分子内氢键缔合,极性较其他位羟基取代时小,且OCH3和OCH2CH3的取代基可能在4、5、8、9、10或11位中的任意2个位置取代,详见质谱裂解途径(见图7C)。

图7 正离子模式下5-乙氧基-6-羟基-8-甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)和可能的裂解途径(C)Fig.7 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and proposed fragmentation pathways(C) of 5-ethoxy-6-hydroxy-8-methoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

二级质谱裂解中7H-AI7O类成分除丢失CO生成[M+H-28]+碎片离子外,结构中8位甲氧基可丢失1个CH3自由基,6位羟基丢失1个H自由基,发生电子重排后,再丢失1个CO分子,当结构中有OCH2CH3取代时,易丢失乙炔分子,生成羟基。因此,可根据碎片离子峰判断7H-AI7O的取代基种类和数目,但不能完全确定7H-AI7O中取代基的具体位置。

3 讨论与结论

目前,本实验仅采集了5批藏菖蒲和5批石菖蒲,样本数量有限、产地较局限,但就目前采集的样本,仍能获得一些信息,藏菖蒲和石菖蒲药材中都存在7H-AI7O类成分;含7H-AI7O类成分的藏菖蒲较石菖蒲的产地分布广;藏菖蒲中所含7H-AI7O化合物的结构种类较石菖蒲的丰富,但研究内容还不够完善,后续将继续扩大标本的采集范围,积累样本数,全面系统地分析不同产地菖蒲属药材中7H-AI7O类成分的分布情况及含量变化规律;对监测到含有丰富的7H-AI7O类成分的菖蒲属药材进行系统分离,获得具体化合物,进一步完善不同取代基7H-AI7O类成分的质谱数据库,为快速准确地检测和确定7H-AI7O类成分的结构提供实验依据。

植物来源的7H-AI7O量极少,前期实验发现[11],在菖蒲中可同时分离得到菖蒲新碱(7H-AI7O结构)和菖蒲碱甲(AA结构),这两个化合物的结构差异主要在于前者在7位多一个羰基,结合7H-AI7O类成分易丢失CO生成[M+H-28]+的裂解特点推测,植物体内7H-AI7O与AA类成分之间可能存在生物转化关系,因此,后续研究中也会开展菖蒲属中药7H-AI7O与AA类成分的生物转化关系,及土壤、气候等因素对植物体内7H-AI7O类成分生物合成的影响,为进一步挖掘菖蒲属中药开窍豁痰,醒神益智的物质基础提供实验依据。