酸豆外果皮黄酮类成分及其抗氧化活性评价

申子佳,陈飞龙,贾朝玉,李大山,张庆芝,李维熙,王文静

云南中医药大学中药学院,昆明 650500

酸豆(TamarindusindicaLinn.)为豆科植物,其果实又名罗晃子、酸角、甜角、罗望子等,原产于非洲,现各热带地均有栽培。我国台湾、福建、广东、广西、云南南部、中部和北部(金沙江河谷)常见[1]。酸豆药用历史悠久,《本草纲目拾遗》中记载“罗晃子……治疗脏腑生虫及小儿食土腹痛”;《滇南本草》中记载“酸饺……治酒化为痰,隔于胃中”。酸豆含有黄酮、原花青素、低聚原花青素、萜类、多糖类及有机酸类等不同结构类型的物质,具有抗氧化、抗炎、抗衰老及降压等生物学活性[2]。

近年来,国内外对酸豆的花、叶、果实及种子的研究逐渐增多,但目前鲜见关于酸豆外果皮成分及其活性研究的报道[3]。为了明确酸豆外果皮的成分及其抗氧化活性,本实验对酸豆外果皮丙酮提取物的化学成分及其抗氧化活性进行了研究,以便对后续酸豆的药用与开发提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

市售酸豆经云南中医药大学普春霞副教授鉴定为酸豆TamarindusindicaLinn.,剥离外果皮、果肉及种子,并分别收集,将外果皮粉碎至粗粉,置于干燥阴凉处备用,并取100 g粗粉留样保存,植物标本(标本编号2021011901)存放于云南中医药大学医鉴戊楼实验室。

Bruker Avance Ⅲ 400核磁共振波谱仪(德国Bruker公司);Hanbon 制备液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司);Agilent 1100 HPLC/TOF高分辨质谱仪(安捷伦科技有限公司);柱色谱硅胶粉(200～300 目)和薄层色谱硅胶G板(青岛海洋化工厂);MCI精细分离树脂(日本三菱化工);D101型大孔吸附树脂(天津波鸿树脂科技有限公司);RP-18反相硅胶(德国Merck公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(GE Pharmacia公司);M200PRO多功能荧光酶标仪(瑞士Tecan公司);PBS磷酸盐缓冲溶液(Solarbio);荧光素钠(Lot:SLBL5470V,Sigma-Aldrich公司);2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(纯度:100%,Lot:WXBB6080V,Sigma-Aldrich公司);水溶性维生素E(纯度≥98.0%,Lot:N2203050045,南京都莱生物科技公司)

1.2 方法

1.2.1 提取分离

酸豆外果皮粗粉23 kg,以三倍体积丙酮室温下浸提4次,每次4 d,合并提取液,减压浓缩642.2 g。取20 g浸膏冷冻干燥备用,其余浸膏用水混悬,依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各萃取液经减压浓缩合并得二氯甲烷萃取部位浸膏135.1 g(Fr.1)、乙酸乙酯萃取部位浸膏86.9 g(Fr.2)、正丁醇萃取部位浸膏161.2 g(Fr.3)。Fr.1经正相硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(50∶1→0∶1,V/V)梯度洗脱,TLC检测合并相同组分得到5部分Fr.1.1～Fr.1.5。Fr.1.2经反复正向硅胶柱层析石油醚-丙酮(5∶1→0∶1,V/V)及重结晶得到化合物11(18 mg)。Fr.1.3经正相硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(50∶1→0∶1,V/V)梯度洗脱,得到4个组分Fr.1.3.1～Fr.1.3.4,Fr.1.3.1经正相硅胶柱层析及Sephadex LH-20凝胶柱色谱反复洗脱得化合物3(5 mg)、4(7 mg)、5(3 mg)。Fr.1.3.3经半制备高效液相色谱(甲醇-水40∶60→55∶45),得化合物10(28 mg,tR= 18 min)、12(5 mg,tR= 13 min)。经Fr.1.4经正相硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(18∶1→0∶1,V/V)梯度洗脱,得到6个组分Fr.1.4.1～Fr.1.4.6,Fr.1.4.5经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱得化合物1(6 mg)、8(8 mg)。乙酸乙酯部位经正相柱层析二氯甲烷-甲醇(50∶1→0∶1,V/V)梯度洗脱,TLC检测合并相同组分,得到6部分Fr.2.1～ Fr.2.6。Fr.2.4经二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶1,V/V)梯度洗脱,得到10个组分Fr.2.4.1～ Fr.2.4.8。Fr.2.4.3经正相硅胶色谱柱二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶1,V/V)以及半制备高效液相色谱(甲醇-水50∶50)分离得到化合物2(4 mg,tR= 6 min)。Fr.2.4.5经正相硅胶色谱柱二氯甲烷-甲醇(10∶1→0∶1,V/V)以及半制备高效液相色谱(甲醇-水65∶35)得化合物17(10 mg,tR= 6 min)、18(10 mg,tR= 7 min)。Fr.2.4.7经反向硅胶柱层析、Sephadex LH-20及半制备色谱分离,得到化合物9(7 mg)、13(10 mg)。正丁醇部位经D101大孔树脂分离,以甲醇-水(0∶100→100∶0,V/V)梯度洗脱,TLC检测合并相同部分,得到5部分Fr.3.1～Fr.3.5,各部分经反向硅胶柱层析,Sephadex LH-20及半制备色谱(水-甲醇20∶50→50∶50)分离,得到化合物6(10 mg)、7(8 mg)、14(6 mg)、15(5 mg)和16(5 mg,tR= 8 min)。

1.2.2 体外抗氧化能力评价

抗氧化能力指数(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)是一种常用的抗氧化能力测定方法。该方法通过抑制氢转移过程终止自由基链式反应。实验采用荧光素钠做荧光指示剂、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)作为过氧自由基并使用标准抗氧化物水溶性维生素E(trolox)进行定量,通过曲线下面积(area under the curve,AUC)进行定量比测定抗氧化能力。本文通过该方法,对酸豆外果皮总提取物、各相萃取物以及分离所得的部分黄酮类化合物进行了体外抗氧化能力测定。具体方法[4]为:在96孔板中分别加入20 μL样品、20 μL PBS及加入20 μL 630 nmol/L荧光素钠,设定没有添加AAPH的荧光自然衰减对照组(-AAPH)和没有抗氧化剂存在时的自由基自然释放对照组(+AAPH),置于酶标仪中37 ℃孵育5 min,随后于-AAPH对照组加入140 μL PBS,其余组迅速加入140 μL 18.2 mmol/LAAPH混匀并启动反应。以激发波长485 nm、发射波长538 nm测定荧光强度,每2 min读数1次,直到荧光衰减至基线为止。将读数值导入Excel连成曲线,以下列公式计算AUC,Trolox的AUC及样品的AUC减去+AAPH组的AUC所得差值为净AUC(net AUC),基于Trolox定量计算ORAC值。AUC = 0.5 ×[2×(f0+f1+… +fn-1+fn) -f0-fn] ×Δt(n为测定次数,f为荧光强度,Δt为相邻两个测定点之间的时间间隔);ORAC = [(AUC样品-AUC+AAPH) / (AUCTrolox-AUC+AAPH)] × [MTrolox/M样品],M为物质的量浓度(μmol/L)。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z287.055 3 [M+H]+,分子式为C15H10O6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.97(1H,s,OH-5),7.41(2H,m,H-2′,H-6′),6.89(1H,d,J= 8.2 Hz,H-5′),6.67(1H,s,H-3),6.45(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),6.19(1H,d,J= 2.1 Hz,H-6);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:163.9(C-2),102.9(C-3),181.7(C-4),157.3(C-5),98.9(C-6),164.2(C-7),93.9(C-8),161.5(C-9),103.7(C-10),119.0(C-1′),113.4 (C-2′),145.8(C-3′),149.7(C-4′),116.1(C-5′),121.5(C-6′)。以上数据与文献[5]报道一致,故鉴定该化合物为木犀草素。

化合物2黄色结晶(甲醇);HR-ESI-MS:m/z271.060 4 [M+H]+,分子式为C15H10O5;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.85(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),7.38(2H,m,H-2′,H-6′),6.85～6.95(3H,m,H-5′,H-6,H-8),6.59(1H,s,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:162.7(C-2),104.5(C-3),176.2(C-4),126.5(C-5),113.1(C-6),162.6(C-7),102.4(C-8),157.4(C-9),116.0(C-10),122.1(C-1′),114.8(C-2′),145.7(C-3′),149.3(C-4′),116.0(C-5′),118.5(C-6′)。以上数据与文献[6]报道一致,故鉴定该化合物为7,3′,4′-三羟基黄酮。

化合物3淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z271.060 4 [M+H]+,分子式为C15H10O5;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.96(1H,s,OH-5),7.92(2H,d,J= 8.9 Hz,H-2′,H-6′),6.92(2H,d,J= 8.8 Hz,H-3′,H-5′),6.78(1H,s,H-3),6.48(1H,d,J= 2.1 Hz,H-8),6.19(1H,d,J= 2.1 Hz,H-6);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.2(C-2),102.9(C-3),181.8(C-4),157.4(C-5),98.9(C-6),163.8(C-7),94.0(C-8),161.5(C-9),103.7(C-10),121.2(C-1′),128.6(C-2′),116.0(C-3′),161.2(C-4′),116.0(C-5′),128.6(C-6′)。以上数据与文献[7]报道一致,故鉴定该化合物为芹菜素。

化合物4黄色结晶(甲醇);HR-ESI-MS:m/z255.065 1 [M+H]+,分子式为C15H10O4;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.84(2H,d,J= 8.7 Hz,H-2′,H-6′),7.80(1H,d,J= 8.7 Hz,H-5),6.91(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),6.86(2H,d,J= 8.7 Hz,H-3′,H-5′),6.83(1H,m,H-6),6.65(1H,s,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:162.6(C-2),104.5(C-3),176.4(C-4),126.5(C-5),114.8(C-6),162.6(C-7),102.5(C-8),160.7(C-9),116.1(C-10),121.8(C-1′),128.2(C-2′),116.0(C-3′),157.4(C-4′),116.0(C-5′),128.2(C-6′)。以上数据与文献[8]报道一致,故鉴定该化合物为7,4′-二羟基黄酮。

化合物5淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z285.075 4 [M+H]+,分子式为C16H12O5;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.86(1H,d,J= 8.7 Hz,H-5),7.54(2H,m,H-2′,H-6′),7.00(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),6.93(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5′),6.90(1H,m,H-6),6.82(1H,s,H-3),3.89(3H,s,3′-OCH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:162.5(C-2),104.9(C-3),176.4(C-4),126.5(C-5),114.8(C-6),162.6(C-7),102.6(C-8),157.5(C-9),116.2(C-10),122.2(C-1′),110.0(C-2′),148.0(C-3′),150.2(C-4′),115.8(C-5′),120.0(C-6′),60.0(3′-OCH3)。以上数据与文献[9]报道一致,故鉴定该化合物为7,4′-二羟基-3′-甲氧基黄酮。

化合物6淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z449.108 0 [M+H]+,分子式为C21H20O11;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.98(2H,d,J= 8.8 Hz,H-2′,H-6′),6.78(2H,d,J= 8.8 Hz,H-3′,H-5′),6.30(1H,d,J= 2.1 Hz,H-8),6.10(1H,d,J= 2.1 Hz,H-6),5.02(2H,d,J= 7.8 Hz,H-1′′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:157.7(C-2),134.2(C-3),178.2(C-4),161.6(C-5),98.5(C-6),164.6(C-7),93.4(C-8),157.1(C-9),104.2(C-10),121.3(C-1′),130.9(C-2′),114.7(C-3′),160.1(C-4′),114.7(C-5′),130.9(C-6′),103.6 (C-1′′),71.6(C-2′′),73.6(C-3′′),68.6(C-4′′),75.7(C-5′′),60.5(C-6′′)。以上数据与文献[10,11]报道一致,故鉴定该化合物为紫云英苷。

化合物7黄色粉末;分子式为C15H10O7;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.75(1H,d,J= 2.1 Hz,H-2′),7.65(1H,dd,J= 8.5,2.1 Hz,H-6′),6.91(1H,d,J= 8.5 Hz,H-5′),6.41(1H,d,J= 2.0 Hz,H-8),6.20(1H,d,J= 2.0 Hz,H-6);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:147.3(C-2),135.8(C-3),178.3(C-4),161.3(C-5),97.8(C-6),164.2(C-7),93.0(C-8),156.8(C-9),103.1(C-10),122.7(C-1′),114.6(C-2′),145.4(C-3′),149.5(C-4′),114.8(C-5′),120.2(C-6′)。以上数据与文献[12]报道一致,故鉴定该化合物为槲皮素。

化合物8黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z287.055 1 [M+H]+,分子式为C15H10O6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.48(1H,s,OH-5)8.04(2H,d,J= 8.9 Hz,H-2′,6′),6.92(1H,d,J= 8.9 Hz,H-3′,5′),6.44(1H,d,J= 2.1 Hz,H-6),6.19(1H,d,J= 2.1 Hz,H-8);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:146.8(C-2),135.7(C-3),175.9(C-4),160.7(C-5),98.2(C-6),163.9(C-7),93.5(C-8),159.2(C-9),103.1(C-10),121.7(C-1′),129.5(C-2′),115.5(C-3′),156.2(C-4′),115.5(C-5′),129.5(C-6′)。以上数据与文献[7]报道一致,故鉴定该化合物为山柰酚。

化合物9黄色粉末;分子式为C16H12O5;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.92(2H,d,J= 8.8 Hz,H-2′,H-6′),6.92(2H,d,J= 8.8 Hz,H-3′,H-5′),6.76(1H,s,H-3),6.47(1H,s,H-8),6.18(1H,s,H-6),3.88(3H,s,4′-OCH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.9(C-2),103.2(C-3),182.1(C-4),161.6(C-5),99.3(C-6),164.1(C-7),94.4(C-8),157.8(C-9),103.9(C-10),121.6(C-1′),128.9(C-2′),116.4(C-3′),161.9(C-4′),116.4(C-5′),128.9(C-6′),56.8(4′-OCH3)。以上数据与文献[13,14]报道一致,故鉴定该化合物为金合欢素。

化合物10白色粉末;HR-ESI-MS:m/z289.070 7 [M+H]+,分子式为C15H12O6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.92(1H,s,H-2′),6.79(2H,brs,H-5′,H-6′),5.90(1H,brs,H-8),5.88(1H,brs,H-6),5.27(1H,dd,J= 12.7,3.0 Hz,H-2),3.06(1H,dd,J= 17.1,12.7 Hz,H-3),2.69(1H,dd,J= 17.2,3.0 Hz,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:80.5(C-2),44.1(C-3),197.8(C-4),165.4(C-5),97.0(C-6),168.3(C-7),96.2(C-8),164.8(C-9),103.4(C-10),131.8(C-1′),114.7(C-2′),146.5(C-3′),146.9(C-4′),116.3(C-5′),119.3(C-6′)。以上数据与文献[15,16]报道一致,故鉴定该化合物为圣草酚。

化合物11黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z273.0754 [M+H]+,分子式为C15H12O5;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.29(2H,d,J= 8.5 Hz,H-2′,H-6′),6.81(2H,d,J= 8.5Hz,H-3′,H-5′),5.88(2H,q,J= 2.2 Hz,H-6,H-8),5.29(1H,dd,J= 13.0,3.0 Hz,H-2),3.08(1H,dd,J= 17.1,13.0 Hz,H-3),2.66(1H,dd,J= 17.1,3.0 Hz,H-3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:80.4(C-2),44.0(C-3),197.7(C-4),165.4(C-5),97.1(C-6),168.3 (C-7),96.2(C-8),164.8(C-9),103.4(C-10),131.1(C-1′),129.0(C-2′),116.3(C-3′),159.0(C-4′),116.3(C-5′),129.0(C-6′)。以上数据与文献[17]报道一致,故鉴定该化合物为柚皮素。

化合物12黄色粉末(甲醇);HR-ESI-MS:m/z271.061 1 [M-H]-,分子式为C15H12O5;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.73(1H,d,J= 8.7 Hz,H-5),6.93(1H,brs,H-2′),6.79-6.82(2H,m,H-5′,H-6′),6.50(1H,dd,J= 8.7,2.1 Hz,H-6),6.36(1H,d,J= 2.1 Hz,H-8),5.32(1H,dd,J= 12.8,2.9 Hz,H-2),3.01(1H,dd,J= 16.9,12.8 Hz,H-3),2.70(1H,dd,J= 16.9,3.0 Hz,H-3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:81.1(C-2),45.0(C-3),193.5(C-4),129.8(C-5),111.7(C-6),166.8(C-7),103.8(C-8),165.5(C-9),115.0(C-10),132.1(C-1′),114.7(C-2′),146.5(C-3′),146.8(C-4′),116.3(C-5′),119.2(C-6′)。以上数据与文献报道一致,故鉴定该化合物为紫铆素。

化合物13白色粉末;分子式为C15H12O6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.31(2H,dJ= 8.5 Hz,H-2′,H-6′),6.80(2H,d,J= 8.5 Hz,H-3′,H-5′),5.89(1H,d,J= 1.8 Hz,H-8),5.84(1H,d,J= 1.7 Hz,H-6),5.03(1H,d,J= 11.4 Hz,H-2),4.56(1H,d,J= 11.4 Hz,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:83.3(C-2),71.9(C-3),198.0(C-4),165.2(C-5),96.6(C-6),168.0(C-7),95.6(C-8),163.8(C-9),100.7(C-10),128.0(C-1′),129.8(C-2′),115.3(C-3′),158.2(C-4′),115.3(C-5′),129.8(C-6′)。以上数据与文献[18]报道一致,故鉴定该化合物为二氢山柰酚。

化合物14淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z289.0704 [M+H]+,分子式为C15H12O6;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.87(1H,s,H-4′),6.74(2H,s,H-2′,H-6′),5.87(2H,s,H-6,H-8),5.37(1H,dd,J= 12.4,2.7 Hz,H-2),3.17(1H,dd,J= 17.0,12.4 Hz,H-3),2.67(1H,dd,J= 17.0,2.7 Hz,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:78.9(C-2),42.5(C-3),196.7(C-4),163.9(C-5),96.2(C-6),167.1(C-7),95.4(C-8),163.3(C-9),102.2(C-10),129.9(C-1′),114.7(C-2′),145.6(C-3′),115.8(C-4′),146.1(C-5′),118.4(C-6′)。以上数据与文献[19,20]报道一致,故鉴定该化合物为5,7,3′,5′-四羟基二氢黄酮。

化合物15淡黄色粉末;HR-ESI-MS:m/z287.055 8 [M-H]-,分子式为C15H12O6;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.32(2H,d,J= 8.6 Hz,H-2′,H-6′),6.82(2H,d,J= 8.5 Hz,H-3′,H-5′),5.89(1H,s,H-8),5.34(1H,dd,J= 12.9,3.1 Hz,H-2),3.11(1H,dd,J= 17.1,12.9 Hz,H-3β),2.70(1H,dd,J= 17.1,3.0Hz,H-3α);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:80.5(C-2),44.0(C-3),197.7(C-4),159.0(C-5),155.5(C-6),165.5(C-7),96.3(C-8),168.5(C-9),103.2(C-10),131.1(C-1′),129.0(C-2′),116.4(C-3′),164.9(C-4′),116.4(C-5′),129.0(C-6′)。以上数据与文献[21,22]报道一致,故鉴定该化合物为5,6,7,4′-四羟基二氢黄酮。

化合物16黄色粉末;分子式为C15H12O7;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.88(1H,s,H-4′),6.74(2H,s,H-2′,H-6′),5.90(1H,s,H-8),5.86(1H,s,H-6),4.97(1H,d,J= 11.1 Hz,H-2),4.49(1H,d,J= 11.1 Hz,H-3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:83.5(C-2),72.0(C-3),198.0(C-4),163.7(C-5),96.5(C-6),167.5(C-7),95.5(C-8),162.9(C-9),100.8(C-10),128.5(C-1′),115.8(C-2′),146.2(C-3′),119.8(C-4′),145.4(C-5′),115.6(C-6′)。以上数据与文献[19]报道一致,故鉴定该化合物为3,5,7,3′,5′-五羟基二氢黄酮醇。

化合物17白色粉末;HR-ESI-MS:m/z289.071 4 [M-H]-,分子式为C15H14O6;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.84(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.77(1H,d,J= 8.4 Hz,H-5′),6.72(1H,dd,J= 8.2,2.0 Hz,H-6′),5.94(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),5.86(1H,d,J= 2.2 Hz,H-6),4.57(1H,d,J=7.5 Hz,H-2),3.98(1H,td,J= 7.8,5.4 Hz,H-3),2.84(1H,dd,J= 16.7,4.7 Hz,H-4),2.51(1H,dd,J= 16.1,8.1 Hz,H-4);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:82.8(C-2),68.8(C-3),28.5(C-4),157.6(C-5),96.3(C-6),157.9(C-7),95.5(C-8),156.9(C-9),100.8(C-10),132.2(C-1′),115.2(C-2′),146.2(C-3′),146.2(C-4′),116.1(C-5′),120.1(C-6′)。以上数据与文献[23]报道一致,故鉴定该化合物为儿茶素。

化合物18白色粉末;HR-ESI-MS:m/z289.072 2 [M-H]-,分子式为C15H14O6;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.98(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.80(1H,dd,J= 8.1,1.9 Hz,H-6′),6.76(1H,d,J= 8.1 Hz,H-5′),5.95(1H,d,J= 2.2 Hz,H-6),5.92(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),4.82(1H,s,H-2),4.18(1H,m,H-3),2.86(1H,dd,J= 16.7,4.7 Hz,H-4),2.73(1H,dd,J= 16.8,3.1 Hz,H-4);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:78.9(C-2),67.5(C-3),29.2(C-4),158.0(C-5),96.4(C-6),157.3(C-7),95.9(C-8),157.6(C-9),100.1(C-10),132.3(C-1′),115.3(C-2′),145.9(C-3′),145.7(C-4′),115.9(C-5′),119.4(C-6′)。以上数据与文献[24]报道一致,故鉴定该化合物为表儿茶素。

化合物1～18结构见图1。

图1 酸豆外果皮中化合物的结构式Fig.1 The structures of compounds from T.indica pericarp

2.2 体外抗氧化活性

本文通过ORAC法对酸豆外果皮丙酮总提物、各萃取物以及其中的槲皮素、山柰酚、柚皮素等11个化合物进行了体外抗氧化活性测定。

2.2.1 标准抗氧化物质Trolox的ORAC

以浓度分别为100、50、25、12.5、6.25和3.125 μmol/L的Trolox按“2.2”项下的方法测定其AUC及net AUC,以浓度为横坐标,net AUC为纵坐标的标准曲线如图2,回归方程为:Y= 0.431X+ 4.155 8,R2= 0.999 1(Y表示抗氧化剂的AUC,X表示抗氧化剂的浓度),实验结果表明Trolox在此实验条件下其AUC与浓度具有良好的线性关系。

图2 Trolox的荧光衰退曲线及标准曲线Fig.2 The fluorescence decay curve and standard curve of trolox

2.2.2 酸豆外果皮丙酮提取物的ORAC

以浓度分为别0.1、0.05、0.025 mg/mL的酸豆外果皮丙酮提取物作为抗氧化剂,按“2.2”项下的方法测定其ORAC值。如图3所示,荧光衰退曲线延缓面积随着浓度的增大而增大,以Trolox(μmol/L)当量表示酸豆外果皮丙酮提取物的抗氧化能力,其浓度与保护时间及ORAC值呈正相关,表明酸豆外果皮丙酮提取物具有较好的抗氧化作用。

图3 酸豆外果皮丙酮提取物的荧光衰退曲线及ORACFig.3 The fluorescence decay curve and ORAC of acetone extract from T.indica pericarp

2.2.3 酸豆外果皮二氯甲烷萃取物的ORAC

以浓度分为别0.1、0.05、0.025 mg/mL的酸豆外果皮二氯甲烷萃取物作为抗氧化剂,按“2.2”项下的方法测定其ORAC值,如图4所示,荧光衰退曲线延缓面积随着浓度的增大而增大,以Trolox(μmol/L)当量表示酸豆外果皮二氯甲烷萃取物的抗氧化能力,其浓度与保护时间及ORAC值呈正相关,表明酸豆外果皮二氯甲烷萃取物具有较好的抗氧化作用。

图4 酸豆外果皮二氯甲烷萃取物的荧光衰退曲线及ORACFig.4 The fluorescence decay curve and ORAC of dichloromethane extract from T.indica pericarp

2.2.4 酸豆外果皮乙酸乙酯萃取物的ORAC

以浓度分为别0.1、0.05、0.025 mg/mL的酸豆外果皮乙酸乙酯萃取物作为抗氧化剂,按“2.2”项下的方法测定其ORAC值,如图5所示,荧光衰退曲线延缓面积随着浓度的增大而增大,以Trolox(μmol/L)当量表示酸豆外果皮乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力,其浓度与保护时间及ORAC值呈正相关,表明酸豆外果皮乙酸乙酯萃取物具有较好的抗氧化作用。

图5 酸豆外果皮乙酸乙酯萃取物的荧光衰退曲线及ORACFig.5 The fluorescence decay curve and ORAC of ethyl acetate extract from T.indica pericarp

2.2.5 酸豆外果皮正丁醇萃取物的ORAC

以浓度分为别0.1、0.05、0.025 mg/mL的酸豆外果皮正丁醇萃取物作为抗氧化剂,按“2.2”项下的方法测定其ORAC值,如图6所示,荧光衰退曲线延缓面积随着浓度的增大而增大,以Trolox(μmol/L)当量表示酸豆外果皮正丁醇萃取物的抗氧化能力,其浓度与保护时间及ORAC值呈正相关,表明酸豆外果皮正丁醇萃取物具有较好的抗氧化作用。

图6 酸豆外果皮正丁醇萃取物的荧光衰退曲线及ORACFig.6 The fluorescence decay curve and ORAC of n-butanol extract from T.indica pericarp

2.2.6 黄酮类单体化合物的ORAC

对从酸豆外果皮中分离所得的部分黄酮类化合物进行了体外抗氧化活性的测定,测定结果如表1,ORAC值越大,代表其抗氧化能力越强。

表1 化合物的ORAC

本实验以AAPH为底物,Trolox做阳性对照,测定酸豆外果皮丙酮提取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及部分单体黄酮的体外抗氧化活性。实验结果表明总提取物及各项萃取物都具有较好的抗氧化活性。单体化合物除紫铆素外,其他9个黄酮类化合物相较于阳性对照均具有良好的体外抗氧化活性。

3 讨论与结论

酸豆中含有黄酮、有机酸、原花青素、低聚原花青素,多糖类及萜类等不同结构类型的物质[25],而酸豆外果皮作为食品加工的副产物通常被人所忽略,本实验从酸豆外果皮中共分离得到18个黄酮类化合物,包括6个黄酮类(1～5、9),2个黄酮醇类(7、8),5个二氢黄酮类(10～12、14、15),2个二氢黄酮醇类(13、16),2个黄烷醇类(17、18),以及一个黄酮苷(6)。其中10个化合物(2、4～6、9、11、13～16)为首次从该属植物中分离得到,提示酸豆外果皮中含有大量黄酮类化合物,与酸豆中所含的大量成分相一致。ORAC实验结果表明,酸豆外果皮的丙酮提取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及9个(1、2、7～10、12、13、17)化合物均具有良好的体外抗氧化活性。

黄酮类化合物的抗氧化活性与其结构之间的关系密不可分,羟基的数量和位置、C环是否存在羰基等对黄酮类化合物的抗氧化作用都具有一定影响[26]。由于黄酮的酚羟基直接参与自由基的清除,因此酚羟基的取代数量对黄酮类化合物的抗氧化效果有着重要的作用。实验结果显示,二氢黄酮类型中的二氢山奈酚的ORAC值大于柚皮素,槲皮素高于木犀草素、山柰酚等其他黄酮类型化合物,可见羟基数量越多,化合物的抗氧化能力越强。研究表明,黄酮类化合物发挥抗氧化活性的主要部位为B环的羟基取代,以B环邻二酚羟基活性最强,该现象可能是由于B环上的邻二酚羟基更易受到电子的进攻所导致[27],实验结果显示木犀草素和山柰酚羟基数量相同,但木犀草素的ORAC值更高,推测可能B环羟基较A环羟基更具抗氧化活性,其邻二酚羟基发挥的作用显著;双键为吸电子基团,其诱导效应可使黄酮的抗氧化能力降低,而双键的存在又可延长黄酮的共轭体系,增强自由基产物的稳定性,提高抗氧化活性;实验结果显示当取代基均相同时,二氢山奈酚的ORAC值大于山奈酚,而紫铆素的ORAC值大于7,3′,4′-三羟基黄酮,可见C环双键的存在对其抗氧化作用的影响还有待研究;二氢山奈酚的ORAC值显著大于儿茶素,可见4位羰基的存在对抗氧化效果具有一定促进作用。本实验对部分黄酮类的抗氧化效果及其结构之间的关系进行了分析,对上述结构影响抗氧化能力强弱的相关结论进行了验证。