分子标记技术在山羊育种中的研究进展

陈晓敏，李沂霖，何炜诺，卢焕聪，廖嘉龙，黄 正，柳广斌

（华南农业大学动物科学学院，广州 510642）

随着生活水平的提高，人们对于优质羊肉的需求量与消费量在持续增长，因此，加快肉羊育种进程，促进肉羊养殖行业发展具有重要意义。分子标记（Molecular markers）是指一种可遗传的、能被定位和识别的DNA 序列，通常由一个基因或者一段核苷酸序列的几个核苷酸发生突变产生，具有检测操作简便、表达稳定等优点，已被广泛应用于畜禽良种选育。然而，分子标记技术在山羊育种中起步较晚、研究应用较少。本文综述了分子标记在山羊生长性状、产肉性状、繁殖性状改良方面的研究进展，并对分子标记技术的未来发展和应用前景进行了展望，以期为以后的山羊育种研究提供一些参考。

1 分子标记技术在山羊生长性状中的研究进展

生长性状是动物重要的经济性状之一，由多个被称为数量性状位点的基因位点控制。我国的山羊生长速度缓慢，制约了养羊业的发展，因此对生长性状相关基因进行选择性育种对于加速我国养羊业发展具有重要意义。近年来，在山羊中已成功找到了多种分子标记辅助育种可利用的基因标记位点，在体尺与体重方面的研究取得了一定的进展。

1.1 体尺性状

体尺性状可反映山羊的遗传潜力。传统育种改良方法，即通过测量山羊的体高、体长等指标了解其生长发育情况，虽然可以辅助选育出具有更好遗传特性的山羊个体，但是进展缓慢且存在遗传进化不确定性。分子标记辅助育种则具有高精确性和高效性，可以快速选择与体尺性状相关的个体，将有助于更有效地提高山羊体尺性状和加快育种进程。

有研究表明，纤毛和鞭毛相关蛋白43（Cilia-and flagella-associated protein 43，CFAP43）基因可能对山羊的体尺性状产生影响。Mi 等［1］提出，CFAP43基因与山羊生长密切相关，该研究还分析了陕北白绒山羊CFAP43基因的3 个插入/缺失多态（L-13、L-16 和L-19）与体尺性状的关系，发现L-13 与胸深相关，L-16 与体长、胸宽、管围和背高相关，L-19 与体长、胸围、管围相关。这些性状的理想基因型大多为缺失/缺失或插入/缺失。Zhou等［2］在陕北白绒山羊中研究了RAR 相关孤立受体A（RAR-related orphan receptor A，RORA）基因的插入/缺失变异和该基因与山羊生长性状的关系时，发现RORA基因中的P11-28-bp 缺失位点与其体高、体长等性状呈显著相关（P＜0.05）。以上研究结果表明，山羊育种时以基因缺失位点为候选分子标记，有望筛选出生长性能优越的优良山羊个体。

Peng 等［3］研究发现，分选连接蛋白29（Sorting nexin 29，SNX29）基因与微管运动蛋白活性有关，其可能是影响屠体的候选基因。Chen 等［4］通过检测SNX29基因的mRNA 表达水平，探讨了SNX29基因中的拷贝数变异（Copy number variation，CNV）对湘东黑山羊生长性状和基因表达的遗传效应，关联分析表明，SNX29CNV 与山羊的胸围、腹围显著相关（P＜0.01），且SNX29基因的CNV 正常型个体更具优势。此项发现表明，SNX29基因可用于肉山羊的标记辅助选择。该研究首次揭示了SNX29基因的CNV 在中国地方山羊改良中的应用前景。

除此以外，关于山羊体尺性状还有其他研究，表1总结了2019—2022 年国内外部分可作为山羊体尺性状选择的潜在分子标记的研究结果。

表1 2019—2021 年国内外部分可作为山羊体尺性状选择的潜在分子标记

综上所述，近年来的山羊体尺性状改良研究主要集中在基因缺失和插入方面，CNV 也有涉及，但是成果较前两者少。由于CNV 的改良效率也相对于传统改良方法效率更高，因此探索空间广阔。

1.2 体重

体重是山羊育种中的一项重要性状，是山羊生长发育和营养状况的重要指标，对于提高山羊的生产性能和经济效益具有重要意义。分子标记辅助育种能够减少繁殖过程中的时间和经济成本，避免了传统育种中需要进行大规模繁殖试验的繁琐程序，还可以有效地避免不良基因的传递，提高遗传改良的效果，为山羊体重性状的精确育种提供有力支持。

Saleh 等［12］对大足黑山羊和内蒙古绒山羊选定个体的全基因组测序进行了重新测序，结果表明，实验羊内含子区的插入/缺失位点对于两个山羊品种都是唯一的，而其中的rs669452874 位点的插入/缺失基因型与两品种羊的体重都呈极显著相关（P＜0.01）；赵森等［13］研究发现，内蒙古白绒山羊的膜相关RING-CH 型蛋白1（Membrane-associated ring-CH protein 1，MARCH1）基因的启动子区7 bp 位点的缺失对该种山羊的体长、体重和体高均存在极显著相关（P＜0.01）；Wang 等［14］研究发现，山羊PR/SET 结构域6（PR/SET domain 6，PRDM6）基因12 bp 的缺失变异对1 周龄山羊的体重有重要影响；Bi等［15］研究发现，在山羊SNX29基因上一个非编码区（17 bp）的插入变异与其体重显著相关（P＜0.05）。以上研究结果表明，这些基因的插入/缺失位点适合作为山羊体重改良育种的潜在分子标记位点，并通过探究其变异方式对山羊体重性状的影响来进一步改良山羊的经济性状。

Li 等［16］分析了黑素蛋白（Opsin 4，Opn4）基因在贵州白山羊群体中的拷贝数分布，发现贵州白山羊中，拷贝数正常类型的个体表现出优越的生长性状，且拷贝数变异位点与体重性状显著相关（P＜0.05）。Ren 等［17］监测出肌源分化1（Myogenic differentiation 1，MyoD1）基因的3种CNV（缺失型、正常型、获得型），发现实验山羊的CNV位点与其体重呈显著相关，并且获得型CNV 在3 种类型中表现出最好的生长性状和良好的一致性。因此，Opn4和MyoD1两种基因的CNV 可作为改良山羊生长性状的候选分子遗传标记，加快山羊优良品种的选育进程。

Alex 等［18］检测了胰岛素样生长因子1 受体（Insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）基因第2 内含子C.546+179170A＞T 在阿塔帕迪黑山羊和马拉巴里山羊中的易位情况，并探讨了该多态性与生长的关系。结果显示，该基因的多态性与体重性状显著相关（P＜0.05）。因此，该基因的易位点可作为肉用山羊品种选择的候选分子标记。

总体而言，目前的研究成果大多集中在基因缺失或插入以及CNV 三部分，主要表现在体尺与体重两方面。不同类型的基因变异对不同山羊的不同生长阶段的影响效果不尽相同。所以在未来，科研人员利用分子标记技术对山羊生长性状进行进一步研究时，基因插入/缺失、CNV 将是可以考虑的主要切入点。

2 分子标记技术在山羊产肉性状中的研究进展

产肉性状直接反映了山羊的生产价值，因此，改良该性状是促进山羊业发展必不可少的一步。山羊产肉性状包括产肉量及肉质两方面，可通过背膘厚、屠宰率、脂肪含量等指标加以衡量。产肉性状受多种因素的调控，通过基因及RNA 的调控可影响肌肉细胞的增殖分化、肌纤维的生长及脂肪的沉积等，进而影响产肉量及肉质。传统的筛选方法改良效率不高，效果也不甚理想，因此近年来不少学者聚焦于分子标记辅助育种，并通过该方法在山羊产肉性状改良方面取得了一定的研究进展［19］。

2.1 肌肉生长

肌肉生长的研究方向大致分为产肉量及肉质纤维嫩度的研究，通过改良肌肉纤维的生长分化，可有效提高山羊的肉质，从而提高山羊的经济价值；同时，合理控制山羊肌肉的高效生长，可有效提高山羊的经济效益。

产肉量方面，MSTN基因可以控制产肉量，这是一种负向调控因子，若机体内缺失了MSTN，则会导致机体肌肉过度生长，这种现象称为双肌现象，在畜禽生产中受到广泛重视［20］。闵令江［21］利用PCR-SSCP 和PCR-RFLP技术对波尔山羊的MSTN基因进行了研究，发现该基因5’调控区的多态位点与山羊的净肉重有极显著影响（P＜0.01）。Zhang 等［22］通过PCR-SSCP 技术对波尔山羊与安徽白山羊的MSTN基因进行了遗传多样性分析，结果验证了MSTN基因的多态性位点是山羊体重的分子辅助选择位点。MSTN基因对山羊产肉量的改良有重大影响，但是近年来通过分子辅助标记技术对山羊MSTN基因进行的研究较少，因此有待更深入的研究。

除了在基因方面的研究，RNA 也成为当前的研究热点。MicroRNA 是一种非编码RNA，在动物肌肉分化环节中，microRNA 和mRNA 在骨骼肌分化中不可或缺［23］，它在一定程度上影响山羊的肉质和产量。相关研究发现，骨骼肌的分化与产肉量密不可分［24］。Junning 等［25］在多个不同表达的mRNA 和差异表达的MicroRNA 中筛选出了涉及肌肉分化的相关基因，结果表明，MiR-1等多个MicroRNA 的高表达、MiR-129-5p等多个MicroRNA 的差异表达以及肌肉特异性mRNA 肌酸激酶M 型（Creatine kinase M，CKM）和肌球蛋白重链亚型（Myosin heavy chain 3 Gene，MYH3）对肌肉的增殖与分化有显著影响，通过合理控制上述多个MicroRNA 及mRNA 的表达，可有效提高骨骼肌细胞的增殖与分化，进而提高山羊的产肉量。王丽娟［26］通过探究MiR-1、MiR-133及其靶基因，即组蛋白去乙酰化酶4（Histone deacetylase 4，HDAC4），血清应答因子（Serum response Factor，SRF）在山羊骨骼肌卫星细胞中的表达规律，验证了MiR-1、MiR-133在转录后水平对山羊骨骼肌细胞相关靶基因的翻译有抑制作用，从而抑制山羊骨骼肌细胞的增殖与分化，进而影响产肉量。Li 等［27］研究发现，通过促进小脑变性相关蛋白1 反义转录物（CDR1 antisense RNA，CDR1as）的表达可以缓解因microRNA 1 引起的胰岛素样生长因子7 受体下调，激活肌肉分化，这在山羊产肉量提高的育种上具有相当潜力。

肉质纤维嫩度方面：钙蛋白抑制素（Calpastatin，CAST）基因可能与山羊肌肉内蛋白质降解有关。汪代华等［28］研究发现，天府肉羊CAST基因可识别并特异性结合被Ca2+激活的钙蛋白酶，进而抑制肌肉内蛋白质的降解并改良肉质，因此认为CAST可作为候选标记位点并进行山羊肉质改良的后续研究。山羊骨骼肌内肌细胞增强因子-2（Myocyte enhancer factor 2，MEF2）基因家族与山羊肌纤维的分化有关。Chen 等［29］研究发现，MEF2家族的表达水平与山羊的肌纤维直径呈显著正相关；通过控制MEF2家族基因的表达，可有效改良骨骼肌肉质嫩度。

2.2 脂肪含量

脂肪含量直接影响山羊肉质的风味，此项指标的改良对山羊肉质的提高具有重要意义。科学界普遍认为脂肪分为皮下脂肪和肌内脂肪［30］。山羊肌内脂肪（Intramuscular fat，IMF）含量及其脂肪酸的组成是影响山羊肉质风味的重要指标［31］。近年来的研究表明，影响山羊脂肪含量的基因及其他因素众多，但目前大部分的研究只能证明所选基因与产肉性状具有一定相关性，可以作为分子标记辅助育种的参考位点，具体作用机理仍有广阔的探索前景。

张浩等［32］通过RT-PCR 和qPCR 技术，筛选出了影响山羊肌肉发育和脂质代谢的重要基因——丙酮酸脱氢酶激酶4（Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4，PDK4）基因，但PDK4基因调控肌内脂肪细胞脂代谢的分子机理尚未明确。该结果表明，在进行山羊产肉性状改良时，PDK4基因可以作为分子标记辅助育种的潜在标记位点进行更深一层的研究；除了基因位点，一些细胞因子也可以作为候选标记位点进行标记育种改良，进而达到改良肉质的效果。转录因子（Transcription factors，TFs）是一类能够调控基因表达的细胞因子［33］。Xu 等［34］成功验证了Kruppel 转录因子9（Kruppel-like factor 9，KLF9）对山羊肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞的分化具有促进作用，影响脂肪含量变化。胡婷婷等［35］研究了简州大耳山羊的转录因子c-fos 原癌基因蛋白（C-fos protooncogene protein，c-fos）在山羊皮下脂肪细胞诱导分化的表达情况，并证实了c-fos 可负向对山羊皮下脂肪细胞的分化进行调控，从而影响山羊肉质脂肪含量的变化。以上结果表明，运用分子标记方法辅助改良山羊脂肪含量时，细胞因子也可以作为一类潜在标记位点进行研究与探索。目前山羊转录因子的研究发现数目相对较少，理论上还存在大量尚未发现的转录因子，亟需更全面的深入研究。

此外，Chang 等［36］通过RT-qPCR 技术对长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）进行了相关研究，发现调节IMF 分化的lncRNA 可能与建州达尔山羊的脂肪含量具有一定的相关性。但由于lncRNA 序列不保守，在山羊上的研究应用起步晚，目前研究方式多以RNA-Seq为主，缺乏利用分子标记技术进行的相关研究［37］。

综上，通过开发新的育种分子标记位点，可以实现山羊品种在脂肪含量、肌纤维直径和产肉量等产肉性状上的遗传改良。在山羊产肉性状方面，研究对象主要涉及基因、细胞因子以及RNA 这几方面，然而影响山羊不同生长阶段肌肉发育和脂质代谢调控的HSL基因、PDK4基因及MSTN基因等有关山羊产肉性状的主要基因的探索仍不够深入，细胞因子与RNA 的研究也十分有限，因此，山羊产肉性状的育种改良仍需进一步深入探索。

3 分子标记技术在山羊繁殖性状中的研究进展

在山羊的育种中，繁殖性状占有十分重要的地位，直接影响山羊的经济效益。但是山羊世代间隔较长，用常规的育种方法所获得的遗传进展十分缓慢，而分子标记技术具有快速、准确地鉴定、筛选出与繁殖性状相关的基因和基因片段等优点，使得近年来分子标记技术在羊繁殖领域的研究增多，为山羊的繁殖提供了重要的理论基础和实践指导。

目前，表型选择和分子辅助选择已成为较常用的育种方法，这些方法对于提高山羊的繁殖力和产羔数等性状具有重要的现实意义［38］。研究人员在这方面进行了深入探索，利用分子标记技术发现与产羔数相关的候选基因，为挖掘主效基因提供了重要参考依据。

于思飞［39］的研究结果表明，溴结构域PHD 锌指转录因子（Bromodomain PHD-finger transcription factor，BPTF）参与了染色质重塑过程，在DNA 复制和转录等过程中发挥功能。杨建琦等［40］研究发现，在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊群体中的BPTF基因存在多态性位点，推测BPTF是影响山羊产羔性状的基因。该研究还利用Sequenom MassARRAY®SNP技术对BPTF基因3 个候选位点进行了分型，并对其与云上黑山羊产羔性能（包括产羔数、初生窝重和断奶窝重）的关联性进行了分析，结果显示，BPTF基因g.48615819 C＞G 位点GC 型个体的产羔数显著大于CC 型个体（P＜0.05）。综上所述，BPTF基因g.48615819 C＞G 位点可以作为产羔数选择的潜在分子标记改良山羊的繁殖性状。

胎盘作为一个过渡性器官，在胎儿生长发育过程中通常具备多种功能，诸如气体交换、供应营养物质、排泄代谢物等［41］。有研究认为，母畜窝产仔数与胎盘效率呈正相关［42-44］。Brew等［45］研究发现，产羔数在一定程度上与胎盘质量、子叶总面积、子叶承载效率呈正相关，而与子叶密度呈负相关，与子叶总数无相关性，因此，为促进产羔数的增加可以通过两种方式来实现，即增加子叶总面积或承载率。

在哺乳动物生殖系统中，骨调素（Osteopontin，OPN）参与精卵结合、受精卵着床、胎盘形成以及妊娠维持等过程［46］，推测骨调素或许会影响产羔数性状。范景胜等［47］研究表明，肥羔型黑山羊OPN基因6 号外显子第69 bp处的G/C 颠倒和第84 bp 处的A/G 转换突变，形成了AA、AB、BB 三种基因型［48］。除子叶密度外，BB 型的胎盘性状、子叶总数、窝羔产数均优于AA 型。由此可见，OPN基因外显子6 或许可以作为一个潜在的分子标记来研究山羊繁殖性状。

有研究显示，甘氨酸受体β（Glycine receptor beta，GLRB）、谷氨酸离子型受体AMPA 型亚基2（Recombinant glutamate receptor ionotropic AMPA 2，GRIA2）和高尔基体相关激酶1B（Golgi associated kinase 1B，GASK1B）基因可能对羊的产羔性状产生影响。Fang 等［49］分析了GLRB、GRIA2和GASK1B三个基因和胎盘性状之间的关系，并筛选了13 个SNPs 位点，其中与窝产仔数和活产仔数相关的有3 个SNP（g.28985790T＞G、g.28986352 A＞G 和g.28987976A＞G）；与子叶总面积相关的SNP（g.29203243G＞A）1 个；与胎盘效率相关的SNP（g.30189055G＞A 和g.30193974C ＞T）2 个；与子叶支持效率相关的SNP（g.30193974C＞T）1 个。因此，这3 个候选基因可能影响大足黑山羊的生殖性状，可作为大足黑山羊生殖性状的候选标记。

除此以外，关于产羔数还有很多研究，详见表2。

表2 2022—2023 年国内外部分可作为山羊产羔数选择的潜在分子标记

总体而言，山羊繁殖性状受基因片段突变的影响较大，不同基因的不同位点突变对山羊的产羔数影响效果存在差异，基因片段的突变将成为一个具有潜力的探索方向。目前，分子标记技术在繁殖性状的研究较多但不够深入，在应用层面并未普及，可以加大对分子标记技术的研究力度，与传统的繁殖性状评价方法相结合，如遗传参数估计、遗传方差分析方法，对繁殖性状相关基因进行精准编辑和修饰，从而探究其对繁殖性状的影响，更加准确地评估繁殖性状的表现和遗传特性。

4 结语

在未来，随着优质羊肉市场需求的不断增长，山羊育种的重要性将日益凸显。作为高效的育种改良方法，分子标记技术在改良山羊生长、产肉和繁殖性状方面都取得了一定的研究进展。在生长性状和繁殖性状上，基因插入/缺失和CNV 可以成为山羊育种改良的一个潜在突破口；在产肉性状上，分子标记辅助育种研究仍不够深入全面，有效基因、细胞因子以及RNA 等方面的探索深度较浅，未来可以继续探讨这几个方面在分子标记辅助山羊育种上的可能性，以求最大程度地提升山羊重要性状的遗传改良效果，进而促进我国山羊养殖业的发展。