新疆阿勒泰部分地区双峰驼乳房炎乳汁样品微生物多样性分析及主要致病菌分离鉴定

李 斌,马万鹏,裴文刚,郑 莹,段琦颖,卢亚宾,李建龙,苏战强

(新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

中国是世界上双峰驼的主要分布区域,新疆阿勒泰地区是双峰驼的主产地之一,不完全统计数据显示:全国约有骆驼36.87万峰,主要分布在新疆、内蒙古、甘肃和青海,新疆存栏18.94万峰,占全国的51.36%。从分布区域广度上看,新疆分布最广,且阿勒泰地区分布最为集中[1-2]。因驼奶对于人类炎症、伤口感染[3]、肺结核[4]、糖尿病[5]等多种疾病具有治疗或辅助治疗的作用,且可作为优质保健营养品备受人们的青睐。近年来新疆地区乳用骆驼养殖业作为特色产业得到了迅速发展,而骆驼乳房炎的流行是制约驼奶产量提高的关键瓶颈[6]。

受双峰驼分布的影响,国外研究主要以非洲地区单峰驼为主,有关哈萨克斯坦等地双峰驼乳房炎样品中细菌多样性的研究尚未见文献报道。目前新疆双峰驼临床型、隐型以及正常驼乳样品中细菌菌群结构以及主要致病菌种类、耐药情况尚未探明[7]。本研究利用Illumina MiSeq 测序技术对比分析临床型、隐型乳房炎及正常驼乳中微生物多样性差异,同时对采集的58份乳房炎驼乳进行细菌的分离鉴定,探究其耐药情况,为阿勒泰地区骆驼乳房炎临床治疗及预防提供理论借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品及实验动物所有骆驼乳样均采自阿勒泰地区福海县、清河县、吉木乃县骆驼养殖场。7周龄雌性BALB/c小鼠,购自新疆医科大学。

1.2 主要试剂细菌生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司;科玛嘉培养基购自杭州贝邦科技有限公司;营养肉汤培养基、琼脂粉、血琼脂、麦康凯培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司;药敏片购自OXOID公司;细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司;Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均购自TIANGEN公司。

1.3 主要仪器电子天平,德国 Sartonrius 公司;PCR仪,美国Thermo Hybaid公司;超净工作台,上海智城分析仪器制造有限公司;凝胶成像仪,美国Amersham Pharmacia Biotech公司;电泳槽、电泳仪,美国Bio-Rad公司。

1.4 样品采集方法在骆驼养殖场无菌采集58份乳房炎及12份正常骆驼乳样品,随机挑选临床型、隐型及正常驼乳样品各3份,每份10 mL,干冰保存,用于细菌多样性检测;其余样品置于冰盒中,36 h内送回实验室,用于细菌分离鉴定。乳房炎样品采用临床症状(乳区红肿、乳汁絮状、血乳)及CMT检查法确定。

1.5 微生物菌群多样性检测将上述9份乳样,分临床型(clinical)、隐型(subclinical)、健康(health)3组,送至派森诺生物公司进行宏基因组测序、分析。使用通用引物进行细菌16S rRNA基因V3-V4区的PCR扩增。338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCA-GCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反应条件:98℃ 2 min;98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共25个循环;72℃ 5 min。测序结果经去噪和ASV/OTU聚类后,进行生物信息学分析。

1.6 细菌分离纯化与鉴定吸取1 mL乳样加入无菌摇菌管内,加入9 mL营养肉汤培养基(含5%胎牛血清),置37℃恒温摇床增菌培养12～16 h。增菌后无菌环境下蘸取上述培养液,分别在营养琼脂培养基(含5%胎牛血清)、科马嘉培养基、麦康凯培养基上划线,培养18～24 h后挑取不同单菌落,继续划线,重复上述操作5次,得到纯化菌株,加入甘油置于-80℃冰箱保存。纯化菌株随后进行革兰染色,观察其形态,结合菌落形态及培养特性,初步确定细菌种类。

随后,根据培养特性及染色结果选择合理的生化鉴定管,进行生化鉴定。

1.7 分子生物学鉴定使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取上述生化反应特性有差异的菌株基因组DNA,以此为模板,以27F/1492R为引物,对其16S rRNA进行扩增。PCR反应体系(20 μL):基因组DNA 1 μL,上下游引物各 1 μL,Premix Taq 10 μL,ddH2O 7 μL。反应条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 1.5 min,共35个循环;72℃ 10 min。PCR反应完成后经 1%琼脂糖凝胶在 20×TAE 电泳液中电泳 30 min,凝胶成像系统中记录结果。然后将PCR产物进行回收与纯化,胶回收产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.8 主要致病菌致病性测定选择分离率最高的3种细菌,首先测定菌液CFU(重复操作3次),随后将小鼠随机分为3组,每组5只,腹腔注射菌液0.5 mL,相同环境下饲养,小鼠自由饮食,观察死亡情况,连续观察7 d,用寇氏改良法计算其LD50,同时设立注射生理盐水作为对照组。死亡小鼠解剖观察病变情况后制作肝脏触片,瑞氏染色观察细菌形态。

1.9 药敏试验移液器吸取100 μ L上述3种菌液,无菌涂布后紧贴不同药物纸片,37℃温箱中培养12 h,用游标卡尺测定抑菌圈直径,记录。

2 结果

2.1 多样性测序

2.1.1物种组成分析 3个样本共得到634 492条有效序列,序列长度分布在400～440 bp之间,峰值长度为430 bp,单个样本高质量序列在74 000～88 000之间。9个样品共鉴定出14门、180科、210属的微生物,选取各组平均丰度值前10细菌,绘制不同分类水平下的物种组成图,结果表明门分类水平下Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes为主要优势菌门,与健康乳样相比乳房炎样品中Proteobacteria升高,Bacteroidetes降低(图1)。

图1 细菌门分类水平的比较

属水平下Aquabacterium、Acidovorax、Caulobacter、Rubrivivax、Asticcacaulis为主要优势菌属,通过组间分析可知临床组和隐型组相对于健康组Aquabacterium、Asticcacaulis升高,而Acidovorax则降低,其中Aquabacterium差异较为显著,而Caulobacter、Rubrivivax丰度的降低更有利于临床型乳房炎的发生(图2)。

图2 细菌属分类水平的比较

2.1.2Alpha多样性分析 以组内样品平均Chao指数,绘制稀疏曲线(图3),3组样品的稀疏曲线逐渐趋于平坦,表明测序量趋于饱和,且物种多样性临床组>隐型组>健康组。以OTU丰度排列为横坐标,以分组中OTU的均值的对数为纵坐标绘制丰度等级曲线(图4),曲线横轴跨度较大,表明物种丰度较高,符合分析要求。

图3 相似度为97%条件下各样本的稀疏曲线

图4 相似度为97%条件下各样本的丰度等级曲线

物种聚类采用average聚类法,选择丰度top 10菌属,对分组中各物种丰度平均值进行归一化处理后,绘制属水平下物种组成热图(图5)。结果显示临床型和隐型乳样中Azospirillum、Novosphingobium、Acidovorax、Deinococcus丰度均降低,Aquabacterium、Asticcacaulis丰度升高;临床型乳样中Burkholderia、Ochrobactrum丰度明显升高,Caulobacter、Rubrivivax明显降低。

2.2 细菌分离及鉴定58份乳样增菌经选择及鉴别培养基纯化后,革兰染色可发现呈葡萄串排列的阳性球菌、短链阳性球菌、革兰阴性杆菌(图6),生理生化鉴定结果表明疑似葡萄球菌果糖、凝固酶、V-P等反应呈阳性(表1);短链阳性球菌CAMP、马尿酸钠、乳糖反应阳性(表2);大多革兰阴性杆菌甲基红、硫化氢等显阴性(表3),分别符合金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌的反应特性。结合16S RNA测序结果表明(图7),58份乳房炎样品中,共分离到金黄色葡萄球菌(27株)、大肠杆菌(16株)、链球菌(14株)、鲍曼不动杆菌(8株)、肺炎克雷伯菌(3株)5种,68株细菌。

表1 金黄色葡萄球菌生化鉴定结果

表2 无乳链球菌生化鉴定结果

表3 大肠杆菌生化鉴定结果

A.金黄色葡萄球菌;B.无乳链球菌;C.大肠杆菌(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1.阴性对照;2～24.部分菌株

2.3 主要菌株致病性测定结果经测定金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的浓度分别为1.39×109,5.7×109,8.4×109CFU/mL,小鼠死亡情况及LD50如表4所示。腹腔注射12 h后开始出现精神萎顿,瘫卧等症状,死亡小鼠大多发生在36～72 h之间,大多死亡小鼠剖检可见肝、脾有水肿或坏死病变,少部分肝脏有出血点,细菌形态与接种菌一致。

表4 部分细菌引起小鼠死亡情况

2.4 药敏试验纸片法检测结果显示驼源金黄色葡萄球菌耐药较为严重,已对青霉素、复方新诺明、头孢西叮等7类药物产生耐药,对红霉素、美罗培南、链霉素等敏感。大肠杆菌对青霉素、林可霉素耐药,对环丙沙星、氨苄西林、链霉素等敏感。无乳链球菌对复方新诺明耐药,对阿米卡星、链霉素等多数药物敏感。

3 讨论

双峰驼虽然与单峰驼、双峰驼、羊驼同属骆驼科,但三者在生理功能[8]、产奶量[9]、环境适应能力以及生活环境[10-11]等方面均有所差异,而国内外关于双峰驼乳房炎样品中微生物菌群的研究尚未见文献报道。张敏等[12]比较分析了新疆克州和塔城地区牛奶、驼奶、马奶、羊奶中细菌多样性差异,结果表明驼奶中Proteobacteria占比87.96%,与本研究健康组的85.22%较为接近,而显著低于牛奶中的97.00%;在属水平上,塔城地区驼乳主要以Escherichia-Shigella、Enterobacter、Lactococcus为主,而本研究健康驼乳中优势菌属为Aquabacterium(17.75%)、Acidovorax(20.44%)、Caulobacter(12.93%)存在显著的差异。这种差异可能与塔城送检驼乳被环境污染有关,一般而言Escherichia-Shigella、Enterobacter属的微生物可能引起动物腹泻或其他疾病,常作为致病菌被检疫[13-14]。而本研究所涉及的乳样已经经过乳房炎筛查且按无菌要求采集,并在采样现场于液氮罐中保存运输,故检测结果更具说服力。

PIYER[15]的调查数据表明,中东地区单峰驼乳腺炎主要病原菌为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌和克雷伯菌。 ABERA等[16]研究结果表明:埃塞俄比亚索马里州骆驼乳房、挤奶桶及市售生乳样品中,葡萄球菌(分离率:89.8%)、链球菌(53.7%)、大肠杆菌(31.5%)、沙门菌(17.6%)、克雷伯菌(5.6%)和肠杆菌(5.6%)为主要致病菌。SELIGSOHN 等[17]报道:尼亚牧民骆驼乳房炎平均感染率为46 %,病原菌以无乳链球菌、非金葡菌葡萄球菌和金黄色葡萄球菌为主,研究结果与本研究细菌分离结果基本一致。玛依拉等[18]在阿勒泰地区福海县的调查结果显示,骆驼乳房炎阳性率为26%[10],与本研究临床型乳房炎3.8%及隐型乳房炎14.7%有较大的差异。

综合来看,随着新疆驼乳产业的快速发展,骆驼乳房炎仍然普遍流行,且最主要的致病菌金黄色葡萄球菌耐药性已经较为严重,建议养殖企业及牧民根据药敏结果合理用药,同时应坚持科学养殖技术培训,以最大限度控制乳房炎的发生。