苏尼特家养双峰驼mtDNA Cytb基因和D-loop序列的遗传多样性

张成东，任战军，杨雪娇

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因和D-loop序列的遗传多样性

张成东，任战军，杨雪娇

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究苏尼特家养双峰驼的遗传多样性，以全面揭示中国双峰驼的起源进化，为科学保护和利用我国的双峰驼遗传资源奠定基础。【方法】 采集15峰苏尼特家养双峰驼(10峰雄驼和5峰雌驼)的血样，提取其DNA，采用PCR方法扩增线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b (Cytb)基因的全序列及D-loop的671 bp序列，进行遗传多样性分析，并结合GenBank中已有的双峰驼的mtDNACytb基因序列和D-loop序列进行系统发育分析。【结果】 苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因中存在10个变异位点，共形成了7种单倍型，单倍型多样度为0.857±0.065，核苷酸多样度为0.001 94±0.002 70，平均核苷酸差异数为2.210；在D-loop的671 bp序列中，存在6个变异位点，共定义了6种单倍型，单倍型多样度为0.714±0.116，核苷酸多样度为0.002 53±0.002 75，平均核苷酸差异数为 1.695。基于Cytb基因和D-loop序列进行的系统发育分析均显示，苏尼特家养双峰驼与野生双峰驼归于2个不同的母系世系，野生双峰驼不是苏尼特家养双峰驼的直接祖先。【结论】 苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因和D-loop序列遗传多态性均比较丰富；苏尼特家养双峰驼与野生双峰驼归于2个不同的母系世系，野生双峰驼不是苏尼特家养双峰驼的直接祖先；家养双峰驼内部存在着一定的遗传分化。

苏尼特家养双峰驼；mtDNACytb基因；mtDNA D-loop序列

家养双峰驼隶属哺乳动物偶蹄目(Artiodactyla)，骆驼科(Camelidae)，骆驼属(Camelus)，双峰驼(Camelusbactrianus)种。我国家养双峰驼主要分布于内蒙古、新疆、甘肃、青海、宁夏5个省区的荒漠和半荒漠地区，是沙漠和荒漠地区人民生活不可缺少的畜力之一。由于主产区相距较远，骆驼品种间血液交流较少，加之受现代交通、农业发展和驼产品开发的影响，骆驼存栏量急速下降，导致品种遗传资源急剧衰竭。因此，揭示各产区家养双峰驼群体的遗传多样性和血缘来源，理清起源进化关系，对骆驼群体遗传资源的保护和开发利用有重要意义。

在家养动物的起源进化研究中，最基本的科学问题是野生祖先的来源、起源地及驯化时间[1]。Stanley等[2]首次对骆驼属物种的线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b(Cytb)基因全序列进行了分析，得出的Camelini-Lamini的分化时间与化石记录一致。这引发了人们用分子学研究方法对家养双峰驼野生祖先来源的不断探索。Wang等[3]认为，骆驼与偶蹄目动物的分化时间为5 500～6 000万年前。Cui等[4]认为，双峰驼和单峰驼在从北美洲往亚洲迁徙之前已经分化。Han等[5]利用EcoRⅠ、PvuⅡ、ScaⅠ内切酶对我国双峰驼资源进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析，发现野生双峰驼和家养双峰驼线粒体基因的酶切条带存在差异，这从一个侧面为野生双峰驼是不同于家养双峰驼的物种提供了分子学证据。而吉日木图[6]研究认为，现存的野生双峰驼具有远古血统和系谱，是家养双峰驼的祖先，其在进化上的分歧时间为600万年。此后，高宏巍等[7]用基因组DNA微卫星标记分析认为，野生双峰驼既不是家养双峰驼的祖先，也不是从家养双峰驼野化而来的。张勇等[8]分析了2峰阿尔金山野生双峰驼和已有的双峰驼的mtDNACytb基因序列，表明现有的双峰驼可分为2个种群：新疆种群和甘肃种群(二者尚未达到种间水平)，二者可能是由2个不同的原始双峰驼祖先种群进化而来的(阿尔金山野生双峰驼属于新疆种群)。程佳等[9]分析了家养双峰驼和野生双峰驼mtDNACytb的部分基因序列，结果表明家养双峰驼起源于同一母系，与野生双峰驼非同一母系起源，认为我国家养双峰驼的祖先与现存的野生双峰驼并非同一个亚种。Ji等[10]对 3 峰野生双峰驼和 18 峰家养双峰驼的mtDNACytb基因序列进行了分析，认为现存的野生和家养骆驼有各自独立的母系起源，而且2个亚种之间的分化可能发生在 70 万年前。以上研究表明，家养双峰驼的野生祖先来源存在一定分歧，而且其起源地及驯化时间等问题也未得到解决，有待进一步研究。

我国骆驼分布在面积约1.1×107km2的干旱荒漠草原上，占我国国土总面积的11.4%，地跨北纬37°～50°、东经76°～124°。依据骆驼生存的地理环境差异及其表型差异，可将其划分为新疆南疆驼、北疆驼、东疆驼，甘肃河西驼，青海驼，内蒙古阿拉善驼和苏尼特驼等地方品种。近年来，对家养双峰驼各地方品种间的遗传差异性研究已有一些报道，权洁霞等[11]利用ApaⅠ、AvaⅠ等18种限制性内切酶对阿拉善沙漠驼、阿拉善戈壁驼和新疆驼3个类群87峰个体的mtDNA进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析，结果表明我国的家驼mtDNA内存在较丰富的遗传多样性，mtDNA在这3个类群之间没有明显的遗传分化，遗传变异主要来自群体内的差异。高宏巍等[7]首次用双峰驼基因组DNA 16个微卫星标记，对中国6个地区和蒙古国7个地区(含5峰野骆驼)的双峰驼进行了研究，结果表明中国和蒙古国家养双峰驼群体间遗传分歧并不显著。王乐等[12]、何晓红等[13]采用微卫星标记对中国不同地区的骆驼进行遗传多样性分析，将中国骆驼划分为2个支系(阿拉善驼、河西驼、东疆驼聚为一个支系，北疆驼和南疆驼聚为另一个支系)。程佳[14]、何晓红[15]对中国家养双峰驼mtDNA D-loop区序列的分析表明，中国家养双峰驼的遗传多样性较为丰富，家养双峰驼存在一次不完全的群体扩张。以上研究结果表明，中国家养双峰驼各种群间存在一定的遗传分化，但因样本含量和研究方法的不同，各种群间的遗传分化结果存在差异，需要扩大样本量和采用多种研究方法进行深入研究。

综上可知，分析mtDNACytb基因和D-loop序列都是研究骆驼母系起源进化的有效手段，但是联合使用这2个基因片段进行研究的文献较少。为了更全面地揭示苏尼特家养双峰驼的遗传多样性水平及其系统地位，本研究拟联合使用mtDNACytb基因和D-loop序列，来研究苏尼特家养双峰驼的遗传多样性及其起源进化问题，以期为科学保护我国的双峰驼遗传资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

在内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗，共采集15峰家养双峰驼(10峰雄驼和5峰雌驼)颈静脉血样10 mL/峰，用ACD抗凝剂抗凝，冰冻带回实验室，-80 ℃保存。

1.2 引物设计与合成

Cytb基因引物使用项目组设计的引物[9]，D-loop序列引物使用文献[14]所用的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其相关信息见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA的提取 骆驼基因组总DNA用血液基因组柱式小量提取试剂盒(来自康威世纪生物科技有限公司)提取，用EpochTM微孔板分光光度计进行核酸定量，并用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测其质量浓度和纯度，质量浓度统一稀释为50 ng/μL，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 mtDNACytb基因和D-loop序列的PCR扩增 各目的基因片段扩增体系均为50 μL，其中2×TaqMaster Mix(含染料) 25 μL、上游和下游引物各2 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 18.5 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(温度依引物而定)40 s，72 ℃ 40 s，34个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化和双向测序。

1.4 测序结果处理及系统发育树的构建

参照GenBank中的基因序列，用DNAMAN软件对测得的Cytb基因片段进行拼接，用Chromas Application 2.3.0.0软件对所测序列峰值进行校正，校对后用MEGA 5.10筛选出不同序列间的变异位点、简约信息位点，确定单倍型。用DNAsp 计算单倍型多样度(Hd) 和核苷酸多样度(Pi)，统计Cytb基因同义密码子的相对使用度。用MEGA 5.10 计算不同单倍型间的遗传距离，构建NJ分子系统进化树。

2 结果与分析

2.1 骆驼基因组DNA的提取

由图1可见，提取的双峰驼基因组DNA浓度和纯度均较高，提取效果较好，可以用于后续的基因扩增操作。

2.2 基于mtDNA Cyt b基因的苏尼特双峰驼的遗传多样性

2.2.1 mtDNACytb基因的PCR扩增结果 由图2可知，Cytb基因的引物能扩增出特异性目的条带，扩增长度为1 140 bp，涵盖了Cytb基因1 140 bp全长序列，可以用于进行后续的测序工作。

2.2.2 mtDNACytb基因的碱基组成及变异 测序得到的15条苏尼特家驼mtDNACytb基因序列，经过序列峰值校正并与GenBank所检索到的家养双峰驼的mtDNA全序列(GenBank序列号：AP003423.1)同源比对后，剪切得到了1 140 bp 的Cytb基因全序列。本研究发现，苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因共有10个变异位点，形成了7种单倍型(H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7；表2)，变异位点占分析位点总数的0.88%，分别位于Cytb基因的261，472，714，723，819，862，911，960，1 000和1 020 bp处，包括8个转换和2个颠换，无插入/缺失突变；有6个简约信息位点。8个转换位点中，T-C转换位点有7个，共发生13次转换；A-G转换位点1个，共发生2次转换。2个颠换位点中，A-C颠换位点1个，共发生1次颠换：A-T颠换位点1个，共发生2次颠换。转换/颠换(R，由DNAsp软件计算得来)为4.82。由表2可知，Cytb基因472，819，1 000 bp处为非同义突变，分别导致了Cytb第158个氨基酸由苏氨酸(T)转变为脯氨酸(P)、第304个氨基酸由异亮氨酸(I)转变为苏氨酸(T)、第334个氨基酸由苏氨酸(T)转变为丙氨酸(A)。表明苏尼特家养双峰驼Cytb基因符合中性进化。

图1 苏尼特家养双峰驼基因组DNA的提取
M.DNA分子量标准；S1M～S5M.5峰雌驼;S1G～S10G.10峰雄驼。图2,4同
Fig.1 DNA of Sunite domestic bactrian camel
D.DNA Marker;S1M-S5M.5 femal camels;S1G-S10G.10 male camels.The same for Fig.2 and Fig. 4

图2 苏尼特家养双峰驼Cytb基因的PCR扩增结果
Fig.2 Amplification ofCytbgene of Sunite domestic bactrian camel

碱基组成分析结果(表3)表明，T、C、A、G的平均含量分别为27.8%，28.2%，29.0%和15.0%。A+T的平均含量(56.8%)高于C+G的平均含量(43.2%)。在Cytb基因中，碱基的使用在密码子的3个位点存在差异，在密码子第1位点4种碱基除A碱基(28.9%)含量略高外,其余碱基使用较为均衡；密码子第2位点和第3位点碱基的使用有明显的偏倚性，密码子的第2位点T碱基平均使用频率高达41.8%，G碱基平均使用频率为13.9%；密码子的第3位点A碱基平均使用频率为38.6%，A+C的平均使用频率高达73.2%，G碱基平均使用频率仅为8.4%。由表4可知，15峰苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因中，不同密码子的相对使用度(RSCU值)不同，RSCU>1的密码子除CGT(R)外均以A或C结尾，说明NNA和NNC型密码子是Cytb基因偏爱的密码子，而以T和G结尾的密码子RSCU值多小于1，说明以T或G结尾的密码子出现的频率较低，是Cytb基因非偏爱的密码子。

表3 苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因的碱基组成
Table 3 Base composition in mtDNACytbgene of Sunite domestic bactrain camel

注：A-1表示密码子1位为A碱基。其他情况依此类推。

Note:“A-1” represents that the first site of a codon is A.The similar for other cases.

在7种单倍型中，H1为优势单倍型，单倍型频率为33.33%(表2)，单倍型多样度为0.857±0.065，核苷酸多样度为0.001 94±0.002 70，平均核苷酸差异数为2.210。表明苏尼特家养双峰驼群体的mtDNACytb基因遗传多样性比较丰富。变异位点的Tajima’s D值(由MEGA 5.10软件计算得到)为-1.071 66，P>0.10，差异不显著，说明苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因符合中性进化。

2.2.3 mtDNACytb基因不同单倍型间的遗传距离 由表5可知，苏尼特双峰驼Cytb基因不同单倍型间的遗传距离为0.001～0.005，平均遗传距离为0.002。单倍型H7与其他单倍型的遗传距离较远，为0.004～0.005，平均为0.004，远大于种内平均遗传距离0.002。野生双峰驼与苏尼特家养双峰驼的遗传距离为0.026～0.028，平均遗传距离为0.027。H2单倍型与野生双峰驼的遗传距离较近，为0.026；H3和H5单倍型与野生双峰驼的遗传距离最远，为0.028。单峰驼与双峰驼的种间遗传距离为0.105～0.116，平均遗传距离为0.108；羊驼与骆驼属的遗传距离为0.171～0.183，平均遗传距离为0.175，单峰驼与羊驼的遗传距离最远，为0.183。

注：FE、DR、LP分别为野生双峰驼、单峰驼、羊驼；对角线下方为遗传距离，对角线上方为标准误。表9同。

Note:FE,DR,and LP represent wild bactrain camel,dromedary camel and lama,respectively.Below the diagonal are genetic distance while above the diagonal are standard error.The same for Table 9.

2.2.4 mt DNACytb基因分子系统进化树的构建 根据表6中Cytb基因序列，用MEGA 5.10软件，以单峰驼和羊驼为外群，基于Kimura 2-parameter Model，采用NJ法构建苏尼特家养双峰驼的分子系统进化树(图3)。由图3可以看出，家养双峰驼与野生双峰驼聚为不同类群，形成一个独立的支系，说明野生双峰驼不是家养双峰驼的祖先。

注：括号中的数据为序列的GenBank登录号。表10同。

Note:The numbers in brackets represent the GenBank numbers of sequences.The same for Table 10.

2.3 基于mtDNA D-loop序列的苏尼特双峰驼的遗传多样性

2.3.1 D-loop序列的PCR扩增结果 由图4可见，PCR扩增出约1 300 bp的特异性目的条带，涵盖了D-loop序列的全长序列，扩增效果较好，扩增产物可以用于胶回收以及后续的测序工作。

2.3.2 D-loop序列的测定 家养双峰驼的D-loop序列全长1 225～1 247 bp，由于D-loop序列中存在连续的Poly G和Poly C结构，造成碱基读取困难，经过序列峰值校正并与GenBank所检索到的家养双峰驼的mtDNA全序列(GenBank序列号：AP003423.1)同源比对、剪切后，本试验只获得了671 bp的可靠序列。对所测的15条序列进行分析发现，苏尼特家养双峰驼D-loop部分序列存在6个变异位点，形成了6种单倍型(H1，H2，H3，H4，H5，H6；表7)，占分析位点总数的0.89%，变异位点分别位于所研究序列的第54，112，161，614，663和666位点，包括5个转换，1个颠换；有4个简约信息位点。A-G转换占变异位点的50%，T-C占33.33%。所研究序列的核酸组成分析结果(表8)显示，T、C、A、G碱基的平均含量分别为26.7%，26.8%，27.9%和18.6%，其中A+T的平均含量(54.6%)高于C+G的平均含量(45.4%)。

6种单倍型中，H1单倍型为优势单倍型，单倍型频率为33.33%(表7)，单倍型多样度为0.714±0.116，核苷酸多样度为0.002 53±0.002 75，平均核苷酸差异数为1.695。变异位点的Tajima’s D值为-0.284 63，P>0.10，差异不显著，说明苏尼特家养双峰驼D-loop序列符合中性进化。

2.3.3 D-loop序列不同单倍型间的遗传距离 由表9可知，苏尼特家养双峰驼D-loop序列不同单倍型间的遗传距离为0.002～0.006，平均遗传距离为0.004。单倍型H6与单倍型H1、H2、H3和H4的遗传距离较远，为0.005～0.006，平均为0.006，大于种内平均遗传距离0.004。野生双峰驼与苏尼特家养双峰驼的遗传距离为0.022～0.025，平均遗传距离为0.024。单峰驼与双峰驼的种间遗传距离为0.045～0.054，平均遗传距离为0.051；羊驼与骆驼属的遗传距离为0.077～0.095，平均遗传距离为 0.092，单峰驼与羊驼的遗传距离最近，为0.077。

2.3.4 mtDNA D-loop序列分子系统进化树的构建 用表10中的D-loop序列，以单峰驼和羊驼为外群，用MEGA 5.10软件，基于Kimura 2-parameter Model+G模型，采用NJ法构建苏尼特家养双峰驼的分子系统进化树(图5 )。由图5可以看出，家养双峰驼与野生双峰驼聚为不同支系，说明野生双峰驼不是家养双峰驼的祖先；不同地区的家养双峰驼存在基因交流，但也有分化的趋势。

3 讨 论

3.1 基于mtDNA Cyt b基因对苏尼特家养双峰驼的遗传多态性研究

由mtDNACytb基因序列分析可知，苏尼特家养双峰驼遗传多样性比较丰富。由mtDNACytb基因系统进化树可知，家养双峰驼基本属于一个母系世系，而与野生双峰驼明显属于不同的母系世系。在家养双峰驼世系内，S8G、S10G、Normal 1和Mongolia聚为一类，并且遗传距离计算显示S8G和S10G与Normal 1、Mongolia遗传距离均为0.001(数据未展示)；阿拉善家养双峰驼(Alashan 2和Alashan 3)与其他双峰驼遗传距离较远，Alashan 3与Mongolia的遗传距离最远，为0.009，与S8G和S10G的遗传距离为0.008；双峰驼Alashan 1、Wuwei 29、Wuwei 32及新疆博乐地区的Xinjiang 1、Xinjiang 2、Xinjiang 3与苏尼特家养双峰驼的遗传距离均较近，说明苏尼特家养双峰驼与中国其他骆驼产区家养双峰驼以及蒙古家养双峰驼均存在基因交流。

苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因不同单倍型间的遗传距离为0.001～0.005，平均遗传距离为0.002，单峰驼与双峰驼的种间遗传距离为0.105～0.116，平均遗传距离为0.108，这与张勇等[8]的研究结果一致。野生双峰驼与苏尼特家养双峰驼的遗传距离为0.026～0.028，平均遗传距离为0.027，与Ji等[10]的研究结果基本一致，远大于家养双峰驼不同类群之间的遗传距离，但是小于单峰驼与双峰驼的种间遗传距离，这说明野生双峰驼在mtDNACytb基因上与家养双峰驼有明显的差异，但未达到种间差异水平。

3.2 基于D-loop序列对苏尼特家养双峰驼的遗传多态性研究

由mtDNA D-loop序列NJ系统发育分析可知，家养双峰驼属于一个世系，而野生双峰驼明显属于另一个独立的世系，与mtDNACytb基因的分析结果一致。家养双峰驼的母系世系可以分为3个类群：Xinjiang 24、Xinjiang 25、Xinjiang 45、Xinjiang 54聚为一类，称之为新疆类群(群内平均遗传距离为0)；S5G、S6G、Qinghai 16、Qinghai 6、Hexi 24、Xinjiang 10、Xinjiang 11、S8G、S10G聚为一类，称之为蒙古类群(因为依据mtDNACytb基因系统进化分析，S5G、S6G、S8G、S10G与蒙古Red、Brown、Normal、Mongolia骆驼遗传距离较近，而与其他骆驼遗传距离较远，故称之为蒙古类群，群内平均遗传距离为0.002)；其余家养双峰驼聚为一类(群内平均遗传距离为0.001)。3个类群间的遗传距离分析显示，新疆类群与蒙古类群的平均遗传距离为 0.008，与其余家养双峰驼类群的平均遗传距离为0.005，蒙古类群与其余家养双峰驼类群的平均遗传距离为0.004，各类群间的平均遗传距离均远大于各类群内的平均遗传距离，说明家养双峰驼世系内在mtDNA D-loop区存在一定水平的分化。

依据mtDNA D-loop序列，苏尼特家养双峰驼平均遗传距离为0.004，苏尼特家养双峰驼与野生双峰驼平均遗传距离为0.024，单峰驼与双峰驼的种间平均遗传距离为0.051，羊驼与骆驼属的平均遗传距离为0.092。

苏尼特家养双峰驼mtDNACytb基因和D-loop序列的遗传多态性均比较丰富。基于mtDNACytb基因和D-loop序列的遗传距离，苏尼特家养双峰驼各单倍型间遗传距离较近，远小于与野生双峰驼间的遗传距离。基于mtDNACytb基因和D-loop序列的系统发育分析显示：家养双峰驼与野生双峰驼分别归为2个不同的母系世系，野生双峰驼不是家养双峰驼的直接祖先。但是，不同地区，以及同一地区间的家养双峰驼存在一定的遗传分化，这些分化对研究家养双峰驼是多母系还是单母系起源有着很高的价值，因此还需要加大品种数量，增大样本量，进行更系统的研究。

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Genetic diversity of mtDNACytbgene and D-loop sequence of Sunite domestic bactrian camel

ZHANG Cheng-dong,REN Zhan-jun,YANG Xue-jiao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The paper studied the genetic diversity of Sunite domestic bactrian camel to reveal the origin and evolution of bactrian camel in China and improve the protection and utilization of bactrian camel genetic resources.【Method】 The mtDNAcytbgene and D-loop of 15 Sunite domestic bactrian camels (10 male and 5 female) were sequenced and whole length mitochondrial DNA (mtDNA) cytochrome b (Cytb) gene and D-loop 671 bp sequence were obtained using PCR.Then genetic diversity and phylogenetic analysis were conducted based on obtained sequences and known sequences from GenBank.【Result】 There were 10 mutation sites and 7 different haplotypes inCytbgene of Sunite domestic bactrian camels,and their haplotype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.857±0.065,0.001 94±0.002 70,and 2.210,respectively.In the 671 bp D-loop sequences,there were 6 mutation sites and 6 different haplotypes,and their haplotype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.714±0.116,0.002 53±0.002 75,and 1.695,respectively.Neighbor joining (NJ) tree of mtDNACytbgene and D-loop sequence showed that Sunite domestic bactrian camel and wild bactrian camel belonged to two different lineages and wild bactrian camel was not the origin of domestic bactrian camel.【Conclusion】 Genetic diversity in mtDNACytbgene and D-loop of Sunite domestic bactrian camel were rich.Sunite domestic bactrian camel and wild bactrian camel belonged to two different lineages,and wild bactrian camel was not the origin of domestic bactrian camel.There was genetic differentiation in domestic bactrian camels.

Sunite domestic bactrian camel;mtDNACytbgene;mtDNA D-loop sequence

2013-10-20

国家自然科学基金项目(2010K01-16)

张成东(1985-)，男，河南泌阳人，在读硕士，主要从事动物遗传资源研究。E-mail：897823725@qq.com

任战军(1966-)，男，陕西淳化人，副教授，硕士生导师，主要从事经济动物研究。E-mail：renzhanjun@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.029

S824.2

A

1671-9387(2015)03-0032-11

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.029.html