山西省2018-2020年猪圆环病毒3型的检测及Cap基因遗传演化分析

孟 帆,薛翼鹏,赵 岳,米瑞娟,吴 忻

(山西农业大学 动物医学学院,山西 太谷 0030801)

猪圆环病毒 3 型(porcine circovirus type 3,PCV3)是由美国的两位科学家于2015年首次分离到的[1-2],属于圆环病毒科、圆环病毒属的新成员,现已在全球养猪国家逐渐蔓延[3-12],给世界养猪业造成了不可估量的损失。作为世界上猪肉消费量最高的国家,中国在全球生猪生产中也发挥着不可低估的作用,自从PCV3病例在我国猪场的存在被学者初次报道以来[12],陆续有学者报道了PCV3在我国各个不同省市的感染[13-26],甚至有学者通过回溯性研究发现近半个世纪以来PCV3已存在于猪群中[14]。猪作为PCV3唯一的宿主,所有的猪均可感染,特别是妊娠母猪和仔猪更易感染[2,7],造成妊娠母猪繁殖障碍,产木乃伊胎、死胎等[1],仔猪出现神经、呼吸、心血管、肠道、泌尿、淋巴、繁殖系统、皮肤等多器官系统的功能紊乱和先天性震颤等[13]。还有研究认为PCV3侵入猪的免疫系统后可造成猪的免疫力降低[24],更容易感染猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒等病原,引起混合感染,对养猪业造成重大威胁[25]。因此对PCV3的流行及遗传变异情况进行综合分析很重要,及时掌握PCV3的流行动态及遗传变异情况,以便提前进行预警,及时进行防控。本研究运用 PCR 技术对2018-2020年在山西省猪场采集的1 125份血清和病、死猪组织样品进行PCV3检测,然后对获得的5份PCV3 阳性样品ORF2序列进行测序,并对ORF2序列和推导出的Cap蛋白氨基酸序列进行遗传变异分析,旨在了解近年来山西省PCV3的流行情况和遗传进化特点,希望为山西省PCV3的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源2018-2020年在山西省忻州、吕梁等11地市猪场,随机从存栏猪的耳静脉或前腔静脉抽取血液,分离血清,并无菌采集病、死猪的淋巴结、扁桃体等组织放入DNA 组织样品保存液备用。

1.2 主要试剂Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0(南京诺唯赞生物科技有限公司提供);premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0)(大连宝生物工程有限公司提供);PCV3型PCR检测试剂盒(哈尔滨元亨生物药业有限公司提供);DNA胶回收试剂盒和普通质粒小提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司提供)。

1.3 引物设计及合成按照文献[3]的方法于PCV3(GenBank中查阅)保守序列设计出1对特异性引物。上游引物PF2:5- AATAAACTATTGATTTTATTTGCACTTGTGT -3′;下游引物PR2:5′- GCCCGGCACCAAAATGA -3′。引物(上海生工生物工程有限公司合成)使用前用DEPC水溶解,浓度为10 μmol/L,-80℃保存备用。

1.4 血清及病料样品DNA的提取把采集到的血清及病料按照Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0操作说明书提取病毒基因组DNA,-20℃保存备用。

1.5 PCR扩增反应按照TaKaRa LA PCRTMKit Ver.2.1试剂盒说明书,以提取的基因组DNA为模板进行扩增。经过优化,反应体系为25 μL:dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)4 μL,10×LA Taq Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)2.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,TaKaRa LA Taq(5 U/μL) 0.25 μL,模板2 μL,DEPC水补充到25 μL。反应条件:94℃ 5 min;进入PCR循环(35)94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s;72℃ 10 min。然后取 PCR产物5 μL进行凝胶电泳试验,而后对扩增结果进行检测。

M.DL2000 DNA Marker;1.PCV PCR产物

1.6 PCV3扩增产物的克隆及序列测定参照文献[25]的方法对PCV3扩增产物进行克隆及序列测定。

1.7 PCV3 ORF2 核苷酸序列分析参照文献[25]的方法将PCV3 ORF2核苷酸序列及推导出的Cap蛋白氨基酸序列与GenBank中己发表的36株PCV3参考株进行同源性及遗传进化分析。

1.8 临床样品的检测用PCR 方法对 2018-2020年采集于山西省猪场的1 125份血清和病、死猪组织样品进行 PCV3 检测和分析。

2 结果

2.1 2018-2020年山西省PCV3型检测结果对山西省 2018-2020年PCV3检测结果显示(表1),2018-2020年山西省PCV3平均阳性率为21.42%,猪场平均阳性率为44.17%。2018-2020年PCV3阳性率呈逐年上升趋势,猪场阳性率整体也呈上升趋势。

表1 2018-2020年山西省部分猪场PCV3检测结果

2.2 PCV3 ORF2核苷酸的扩增结果用引物对PCV3阳性样品进行PCR扩增,凝胶电泳结果显示扩增出与预期片段大小相同的900 bp扩增条带(图1)。

2.3 PCV3 ORF2核苷酸序列分析山西省5株PCV3 ORF2核苷酸序列大小均为645 bp,编码214 aa。将山西省5株PCV3 ORF2核苷酸序列与36株国内外不同地区的PCV3 ORF2 核苷酸序列进行同源性比较,结果表明(图2),41株PCV3 ORF2 核苷酸序列同源性为97.5%～100.0%;山西省5株PCV3 ORF2 核苷酸序列同源性为99.2%～100.0%,与36株PCV3参考株ORF2 核苷酸序列同源性为98.1%～99.8%。其中,山西省5株PCV3 ORF2 序列中PCV3-SXCZ株与 PCV3-SXYC株之间核苷酸同源性最高,为100.0%,PCV3-SXJC株与PCV3-SXXZ株之间核苷酸同源性最低,为99.2%。山西省5株PCV3 ORF2序列与国外13株PCV3参考株ORF2 序列之间,PCV3-SXJZ株与4332-7_Denmark_2017株(丹麦)ORF2 序列核苷酸同源性最高,为99.8%,PCV3-SXXZ株与PCV3-RU/SM17株(俄罗斯)ORF2 序列核苷酸同源性最低,为98.3%;与国内23株PCV3参考株之间,PCV3-SXXZ株与PCV3/CN/Jiangxi-3/2016株(江西)及PCV3/Pig/CN/ShanXi170709株(陕西)ORF2 序列核苷酸同源性最高,为99.8%,PCV3-SXJC株与PCV3-CN/FuJian-318-2017株(福建)及PCV3-CN/FuJian-820-2016株(福建)ORF2 序列核苷酸同源性最低,为98.3%。进一步分析结果表明(图3),山西省5株PCV3 ORF2 核苷酸序列与36株国内外不同地区的PCV3参考株相比,仅存在几处碱基的突变,PCV3-SXJC株有1个核苷酸的差异,即13位C→T;PCV3-SXCZ株有1个核苷酸的差异,即70位C→T,同737-8_Spain_2017(西班牙)一致。

图3 PCV3 ORF2核苷酸序列比较

2.4 PCV3 ORF2 核苷酸序列系统发生树分析在分析山西省5株PCV3 ORF2序列和36株国内外不同地区的PCV3参考株的ORF2序列核苷酸同源性结果的基础上,构建了PCV3 ORF2核苷酸序列系统进化树。进化树结果显示(图4),41株PCV3流行株分成2大分支,分别为3a和3b基因群,其中山西省5株PCV3流行株都属于3b基因群。进一步分类可以看出,PCV3-SXJC株与PCV3/CN/Henan/2/2016株(河南)亲缘关系较近,PCV3-SXJZ株、PCV3-SXYC株和PCV3-SXCZ株与PCV3-BJ-1_2016株(北京)、4332-7_Denmark_2017株(丹麦)和PCV3-Chian/GX2016-2株(广西)位于同一小分支亲缘关系较近,PCV3-SXXZ株与GD-GZ/2017株(广东)、PCV3/CN/Qinghai/2016株(青海)和PCV3/CN/Jiangxi-3/2016株(江西)亲缘关系较近。

图4 PCV3 ORF2系统发生树

2.5 PCV3Cap蛋白氨基酸序列分析结果显示(图5),41株PCV3 ORF2核苷酸序列推导的氨基酸同源性为96.7%～100.0%;山西省5株PCV3序列之间Cap蛋白氨基酸同源性为98.1%～100.0%;与36株参考株之间Cap蛋白氨基酸同源性为97.2%～100.0%。山西省5株PCV3 Cap蛋白氨基酸序列中,PCV3-SXCZ株与 PCV3-SXJZ株之间Cap蛋白氨基酸同源性最高,PCV3-SXJZ株与 PCV3-SXYC株之间Cap蛋白氨基酸同源性最高,均为100.0%,PCV3-SXXZ株与PCV3-SXJC株之间Cap蛋白氨基酸同源性最低为98.1%。山西省5株PCV3 Cap蛋白氨基酸序列与国外13株PCV3参考株之间,PCV3-SXCZ株、PCV3-SXJZ株和PCV3-SXYC株与DE41.16株(德国)、PCV3-SWE84-2004株(瑞士)Cap蛋白氨基酸同源性最高,PCV3-SXXZ株与PCV3-BR-RS-8株(巴西)、1621_Italy_2017株(意大利)、PCV3/MEX/GTO/01/2017株(墨西哥)、SJ株(韩国)、737-8_Spain_2017株(西班牙)Cap蛋白氨基酸同源性最高,PCV3-SXJC株与PCV3/Thailand/PB01/17(泰国)株Cap蛋白氨基酸同源性最高,均为100.0%,PCV3-SXXZ株与PCV3-RU/SM17株(俄罗斯)氨基酸同源性最低,PCV3-SXJC株与GM2124-2/2016株(日本)氨基酸同源性最低,均为97.7%;与国内23株PCV3参考株之间,PCV3-SXCZ株、PCV3-SXJZ株和PCV3-SXYC株与CHN_Shanghai_0706_2016株(上海)、PCV3-CN/FuJian-512-2016株(福建)、PCV3-CN/FuJian-1215-2016株(福建)Cap蛋白氨基酸同源性最高,PCV3-SXXZ株与PCV3/CN/Jiangxi-3/2016株(江西)、PCV3/Pig/CN/Shanxi170709株(陕西)、PCV3-CHN/CC2016株(吉林长春)、PCV3/CN/Chongqing-148/2016株(重庆)Cap蛋白氨基酸同源性最高,PCV3-SXJC株与PCV3/CN/Anhui/2016株(安徽)、PCV3/CN/Henan/2/2016株(河南)、PCV3/CN/Shandong-1/201703株(山东)Cap蛋白氨基酸同源性最高为100.0%,PCV3-SXJC株与GD-GZ/2017株(广东)Cap蛋白氨基酸同源性最低为97.2%。进一步分析显示,山西省5株PCV3 Cap蛋白氨基酸序列较为保守,没有出现不同于其他流行株的特异性突变。

3 讨论

PCV3型虽然是2016年才发现的一个新型病毒[1-2],但实际上至少已在中国猪群中存在了近半个世纪之久[14],猪只感染后造成妊娠母猪繁殖障碍,仔猪多器官系统功能紊乱、先天性震颤等,病毒侵入猪的免疫系统后引起猪免疫力降低,极易感染其他病毒,引起混合感染,造成猪只生产性能降低,PSY指标下降,对中国猪业造成了严重的影响。近年来,随着山西省生猪产业的迅猛发展,对山西地区PCV3型进行分子流行病学调研和遗传变异分析很重要,可以及时掌握PCV3的流行动态及遗传变异情况,基因的缺失、嵌入和重组可导致病毒毒力增强或致弱,结合临床表现及早做出分析,有利于提前进行预警,对重点防控工作做出调整,及时进行应对。

2018-2020年间通过对山西省PCV3型的分子流行病学调研,发现PCV3在山西省各地市的猪场都有检出,PCV3平均阳性率为21.42%,猪场平均阳性率为44.17%,说明PCV3在山西省猪场感染严重,已呈流行态势,平均阳性率呈逐年上升的趋势。郭影成等[16]报道吉林省2015-2017年PCV3型样品阳性率和猪场阳性率都呈逐年上升的趋势;段群棚等[17]报道2017-2019年间广西PCV3型样品阳性率和猪场阳性率都呈逐年上升的趋势;李勇等[15]对华东地区猪场从2011-2017年不同季节采集的 600多份样品进行了回溯性筛查,结果发现猪场一直存在PCV3型的感染,感染率呈逐年上升的趋势,且在春冬季节相对较高,没有呈现出明显的规律性;刘燕等[19]对2017-2019年从郑州地区猪场采集的1 175份样品进行PCV3型检测,结果发现,2017-2019年郑州地区猪场PCV3型阳性率呈现逐年上升的趋势;这些报道都与本研究结果相一致。可见目前山西省PCV3型感染在猪场已呈流行态势,形势不容乐观,只能凭借健全的生物安全措施加以防控,因此必须引起相关从业者的高度重视,把该病的净化及综合防控列入日常工作中。PCV3包含2个主要开放阅读框(ORF)[1],其中复制酶蛋白Rep由ORF1编码,衣壳蛋白Cap由ORF2编码,对PCV3的ORF2序列进行遗传变异分析意义深远。对获得的5份PCV3 阳性样品的ORF2序列进行测序,并对ORF2序列和推导出的Cap蛋白氨基酸序列进行遗传变异分析,发现山西省5株 PCV3的ORF2核酸序列均为645 bp,编码214个氨基酸,5株 PCV3 ORF2之间核苷酸和Cap蛋白氨基酸同源性分别为 99.2%～100.0%和 98.1%～100.0%,与36株参考株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为98.1%～99.8%和 97.2%～100.0%;可见PCV3之间ORF2核苷酸序列和Cap蛋白氨基酸序列同源性都很高,这与苏战强等[18]的研究结果相一致。Cap蛋白氨基酸序列没有出现不同于其他毒株的特异性突变,表明PCV3在山西较为保守,尚未出现明显变异。PCV3 ORF2核苷酸序列系统进化树结果显示,山西5株PCV3流行株都属于3b基因群,表明近年来山西PCV3流行株以PCV-3b亚型为主。其中PCV3-SXJC株与PCV3/CN/Henan/2/2016株(河南)亲缘关系较近,PCV3-SXJZ株、PCV3-SXYC株和PCV3-SXCZ株与PCV3-BJ-1_2016株(北京)、4332-7_Denmark_2017株(丹麦)和PCV3-Chian/GX2016-2株(广西)位于同一小分支,亲缘关系较近,PCV3-SXXZ株与GD-GZ/2017株(广东)、PCV3/CN/Qinghai/2016株(青海)和PCV3/CN/Jiangxi-3/2016株(江西)亲缘关系较近,可见山西PCV3流行株来源并不单一,因此山西各养猪场应该提高风险意识,在引种时加强检疫、隔离措施等;另外应加强杀虫灭鼠、定期监测、自繁自养等生物安全措施的防控。

本研究结果为探讨PCV3在山西省的流行和遗传进化特点提供了理论参考,以期为山西省PCV3的科学防控提供依据。