MMP-9和Kiss-1在恶性多形性腺瘤中的表达

金 啸 宋 萌

恶性多形性腺瘤占涎腺恶性肿瘤的15%～20%，其生物学特性为无包膜或包膜不完整，呈浸润性生长，容易复发，可发生颈淋巴结转移，并可远隔转移至肺、骨、脑和内脏等[1]。目前，口腔颌面外科领域对于涎腺多形性腺瘤的研究很多，但对于恶性多形性腺瘤的研究很少，本课题组根据细胞外基质金属蛋白酶在多形性腺瘤中的表达等前期研究成果[2]，进一步研究发现基质金属蛋白酶家族中的MMP-9（matrix metalloproteinase-9）在恶性多形性腺瘤的浸润性生长及转移中具有重要作用[3]。MMP-9属IV 型胶原酶,其最主要降解底物是细胞外基质中基底膜的主要结构蛋白IV型胶原[4，5]，现有的研究表明它与大多数肿瘤的发生、发展呈正相关[6，7]。Kiss-1（Kisspeptins-1）基因是一种肿瘤转移抑制基因，又称转移抑素，Kiss-1可以干扰核转录因子-kBp65（Nuclear-factor-kBp65）与MMP-9 基因启动子结合从而减少MMP-9 的表达[8]。本实验通过检测MMP-9 和Kiss-1 在恶性多形性腺瘤病例不同的TNM 分类中的表达，探讨MMP-9 在该肿瘤侵袭转移中的生物学意义，并进一步研究Kiss-1 的表达与MMP-9表达的相关性，找到调控该肿瘤细胞浸润性生长的相关基因，为临床上探索解决恶性多形性腺瘤复发和转移的难点提供有效的干预途径。

资料和方法

1.临床资料

选取上海市第一人民医院口腔颌面外科2010年～2018 年间的手术病例，病理报告为恶性多形性腺瘤的组织标本47 例。其中男性24 例，女性23 例，年龄29 岁至78 岁，平均年龄52.6 岁。随访47 例，随访率100%。肿瘤患者的病变发生于腮腺、颌下腺、舌下腺及唇、颊、腭部的小唾液腺。所有病例均为首发病例，术前均未行任何相关的抗肿瘤治疗。根据口腔颌面部肿瘤TNM 分类：T 原发肿瘤（T1 肿瘤最大直径≤2 cm；T2肿瘤最大直径＞2 cm，≤4 cm；T3 肿瘤最大直径＞4 cm）；N区域性淋巴结转移；M远处转移。47 例病例根据原发肿瘤大小；有无区域性淋巴结转移；有无远处转移进行分组，其中T1（肿瘤最大直径≤2 cm）9 例、T2（肿瘤最大直径＞2 cm,≤4 cm）22 例、T3（肿瘤最大直径＞4 cm）16 例；有区域淋巴结转移35 例、无区域淋巴结转移组12 例；有远处转移31 例、无远处转移16 例。所有病例经术后随访，首次手术治疗后5 年内33 病例未出现复发，14 例出现复发，5 年治愈率约为70.2%。另选取同期23 例手术切除的因外伤无法保留的患者正常涎腺组织作为对照，对照组病例无涎腺功能异常、炎症、瘤样病变及肿瘤病史，其中男性12 例，女性11 例，年龄25岁至79岁，平均年龄52.2岁。

2.方法

（1）HE染色及免疫组织化学SP法

RM2135 石蜡切片机德国LEICA 公司，苏木素染液购自国药集团化学试剂有限公司，伊红Y 染料购自国药集团化学试剂有限公司。单克隆抗体MMP-9 及Kiss-1 购自美国Santa Cruz 公司。DAB显色试剂盒购自华美生物技术公司。SP 试剂盒购自博士德生物技术公司，使用该公司免疫组织化学SP 试剂盒,常规免疫组织化学染色、DAB 显色，苏木素复染，常规封片。以PBS 代替一抗做阴性对照。显微镜及成像系统日本Nikon 公司，数码拍照系统Viewfinder3.0.1。

常规免疫组化染色：切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS洗2～3次各5分钟；滴加3%双氧水，室温静置10 分钟；PBS 洗2～3 次各5 分钟；0.1%胰蛋白酶37℃消化20分钟；PBS洗2～3次各5分钟；滴加血清封闭液，室温20 分钟。去除多余液体，滴加Ⅰ抗（1：200 稀释），4℃湿盒过夜。37℃复温45 分钟。PBS 洗3 次各5 分钟；滴加Ⅱ抗，37℃静置1 小时；PBS 洗3 次各5 分钟；DAB 显色5～10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15分钟；脱水、透明、封片、镜检。

（2）结果判定

MMP-9 及Kiss-1 蛋白染色主要定位于细胞胞浆中。在胞浆内出现均一的棕黄色颗粒,着色颗粒强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。阳性染色细胞选取条件为细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比明显。视野选取染色均匀的肿瘤区。每张切片随机选取5 个高倍视野（×200），各计数200 个细胞，阳性细胞数取均值，再计算该标本的阳性表达率。无阳性细胞为0 分，阳性细胞≤10%为1 分，11%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。按着色强度判断，无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色强度积分与数量积分的乘积＜3分判定为免疫反应阴性“-”，满3分判定为免疫反应阳性“+”，满4分记为“++”较强阳性，5分以上为“+++”强阳性。

（3）统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件对免疫组织化学结果进行卡方（χ2）检验（chi-square test）比较T1、T2、T3三组病例之间的阳性表达率；有淋巴结转移与无淋巴结转移病例中的阳性表达率；有远处转移和无远处转移病例中的阳性表达率之间的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有显著统计学意义。采用Spearman相关（Spearman’s rank correlation）分析，检验MMP-9 及Kiss-1 在47 例恶性多形性腺瘤组织中阳性表达的相关性，P＜0.05 为二者的相关有统计学意义。

结 果

恶性多形性腺瘤HE 染色病例切片：上皮细胞成分丰富，大小不等，核多形性，出现异常核分裂象。肿瘤细胞排列仍有管腔特征，有的管腔内有粘液，有瘤细胞侵入周围血管、淋巴管，见玻璃样变，间质骨化（图1）。

图1 恶性多形性腺瘤HE染色（ ×200）

MMP-9 在正常涎腺组织的腺小叶内有极少量表达，见图2。

图2 MMP-9在正常涎腺组织中极少量的表达免疫组织化学分析（ ×200）

MMP-9 主要表达于恶性多形性腺瘤肿瘤细胞的胞浆内，腺泡及导管上皮都有表达，见图3。

图3 MMP-9在恶性多形性腺瘤中的腺泡、导管都有表达 免疫组织化学分析（ ×200）

MMP-9 在恶性多形性腺瘤无区域淋巴结转移病例中呈阳性表达，见图4。

图4 MMP-9 在恶性多形性腺瘤无淋巴结转移病例阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

MMP-9 在恶性多形性腺瘤有区域淋巴结转移病例中强阳性表达，见图5。

图5 MMP-9 在恶性多形性腺瘤有淋巴结转移病例中强阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

MMP-9 在恶性多形性腺瘤无远处转移病例中呈阳性表达，见图6。

图6 MMP-9 在恶性多形性腺瘤无远处转移病例中阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

MMP-9 在恶性多形性腺瘤有远处转移病例中强阳性表达，见图7。

图7 MMP-9 在恶性多形性腺瘤有远处转移病例中强阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

47 例恶性多形性腺瘤病例中，38 例MMP-9 表达阳性，9 例MMP-9 表达阴性。MMP-9 在恶性多形性腺瘤T1、T2、T3组病例中的阳性表达率无差异（P＞0.05）。MMP-9 在恶性多形性腺瘤有区域淋巴结转移病例中的阳性表达率显著高于无区域淋巴结转移病例（P＜0.01），有远处转移组病例中的阳性表达率显著高于无远处转移病例（P＜0.01），详见表1。

表1 MMP-9的阳性表达率

Kiss-1在正常涎腺组织腺管上皮细胞的胞浆中均有表达，见图8。

图8 Kiss-1 在正常涎腺组织中腺管上皮细胞中阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

Kiss-1主要表达于恶性多形性腺瘤肿瘤细胞的胞浆内，阳性表达分布于腺泡及导管上皮，见图9。

图9 Kiss-1 在恶性多形性腺瘤中的腺泡、导管都有表达免疫组织化学分析（ ×200）

Kiss-1在恶性多形性腺瘤无区域淋巴结转移病例中强阳性表达，见图10。

图10 Kiss-1 在恶性多形性腺瘤无淋巴结转移组强阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

Kiss-1在恶性多形性腺瘤有区域淋巴结转移病例中弱阳性表达见图11。

图11 Kiss-1 在恶性多形性腺瘤有淋巴结转移组中弱阳性表达免疫组织化学分析（×200）

Kiss-1在恶性多形性腺瘤无远处转移病例中强阳性表达，见图12。

图12 Kiss-1 在恶性多形性腺瘤无远处转移组中强阳性表达免疫组织化学分析（ ×200）

Kiss-1在恶性多形性腺瘤有远处转移病例中弱阳性表达见图13。

图13 Kiss-1在恶性多形性腺瘤有远处转移组弱阳性表达免疫组织化学分析（×200）

47 例恶性多形性腺瘤中，21 例Kiss-1 表达阳性，26 例Kiss-1 表达阴性。Kiss-1 在恶性多形性腺瘤T1、T2、T3 组病例中的阳性表达率无差异（P＞0.05）。Kiss-1 在恶性多形性腺瘤有区域淋巴结转移病例中的阳性表达率显著低于无区域淋巴结转移病例（P＜0.01），有远处转移组病例中的阳性表达率显著低于无远处转移病例（P＜0.01），详见表2。

表2 Kiss-1的阳性表达率

MMP-9 在恶性多形性腺瘤中的表达与Kiss-1的表达具有负相关性，r=-0.324，P＜0.05，详见表3。

表3 MMP-9与Kiss-1的相关性

讨 论

恶性多形性腺瘤的临床表现为生长迅速，局部有疼痛与麻木感，肿物与周围组织粘连固定等，其生物学特点与一般腺癌的生物学特性相似，容易复发并可发生远隔转移[9]。因此，对于与该肿瘤细胞局部浸润生长及侵袭、转移等生物学特性相关的基因MMP-9 成为研究的热点，且恶性多形性腺瘤的发生、发展是一个涉及到多个致癌基因和抑癌基因相互作用的复杂过程，因此应该在对某一基因进行研究的基础上进行多个基因之间相互关系的研究，从而更好的从分子水平上阐述该型肿瘤的发生、发展以及浸润、转移的具体生物学机制。目前的研究证实，MMP-9 属IV 型胶原酶,该酶最主要的降解底物是基底膜的主要结构蛋白IV 型胶原,而这正是肿瘤细胞突破基底膜，向周围组织浸润生长的生物学基础[10，11]。因此研究探讨MMP-9 在恶性多形性腺瘤中的表达对于研究该型肿瘤易于侵袭、转移的生物学特性具有重要意义。本研究显示恶性多形性腺瘤有区域淋巴结转移的病例中MMP-9 的表达显著高于无区域淋巴结转移的病例；有远隔转移病例中MMP-9 的表达要显著高于无远隔转移病例，这证明：MMP-9 可以降解细胞外基质，破坏基底膜的完整性并促进肿瘤细胞的浸润性生长[12，13]，其在恶性多形性腺瘤的区域和远隔转移中具有重要的促进作用。MMP-9 作为降解基底膜及细胞外基质的主要因子，恶性多形性腺瘤细胞可直接分泌或诱导宿主细胞分泌该型酶降解基底膜及细胞外基质，为该型肿瘤细胞浸润开辟通道，从而促进肿瘤细胞向周围组织浸润生长。目前的研究表明，编码基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子和细胞间黏附分子等在肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用的基因上都有NFkBp65 的结合位点，NF-kBp65 通过调控这些因子的转录,从而促进肿瘤的浸润、转移[14，15]。Kiss-1（Kisspeptins-1）基因是一种肿瘤转移抑制基因又称转移抑素[16，17]，可以干扰NF-kBp65 蛋白与MMP-9基因启动子结合从而抑制MMP-9 的表达[18，19]。本研究显示，作为已知的对于MMP-9的表达具有负调控作用的肿瘤转移抑制基因Kiss-1，其在恶性多形性腺瘤有区域淋巴结及有远处转移病例中相对低表达，造成MMP-9 的表达没有得到有效抑制，增加肿瘤细胞的浸润生长及转移的倾向。而Kiss-1在恶性多形性腺瘤无区域性淋巴结转移及无远处转移病例中的相对高表达可干扰MMP-9 基因的相关转录过程，从而抑制MMP-9 的表达，减少了患者的区域淋巴结转移率及远隔转移率。本研究不仅证明了MMP-9 与Kiss-1 的表达具有负相关性，也表明Kiss-1 的相对高表达可以抑制涎腺恶性多形性腺瘤的区域淋巴结转移和远处转移，这为临床上找到减少恶性多形性腺瘤的复发和转移提供了新的方法和途径。