PD1免疫治疗前后口腔癌患者T细胞免疫功能的变化

冯 良 尹 克 张素欣 陈 中 包 阳 李天客

口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤。2010 年，美国疾病控制中心统计表明，在全球每年约有50 万人患口腔癌，导致约1.2 万人死亡[1]。其中发展中国家的发病率高于发达国家。口腔颌面部的恶性肿瘤在我国以舌癌、牙龈癌、颊癌等较为常见，由于特殊的部位，对患者术后功能和心理的影响巨大[2～5]。虽然口腔癌在我国的发病率低，但由于人口基数很大，每年有近4.65 万例新发病例[6]。至今口腔癌的病因尚不清楚，但研究表明，吸烟、饮酒、口腔卫生差、饮食和免疫状况等因素与口腔癌有关[7～9]。近年来，随着分子生物学和免疫学的发展，相关研究人员从分子角度和基因表达等微观层面进行了一系列研究，从而使肿瘤的发病机制更加明了，其中免疫因素备受学者的关注[10，11]。

T淋巴细胞是机体重要的免疫细胞之一[12，13]，其产生于胸腺，当初始T 细胞进入外周淋巴器官或淋巴组织后，一旦接触了抗原提呈细胞提呈的、与抗原受体相匹配的抗原肽，它们便代谢活跃并增殖分化[14]。当再次与相同的抗原相遇时，它们会迅速转化繁殖，形成大量的效应T 细胞，从而引发更强的免疫反应，使机体对抗原保持长期免疫[15，16]。

恶性肿瘤是降低人类生活质量和生存时间的重要原因之一。机体自身的抗肿瘤免疫系统通过免疫细胞和细胞因子等参与对肿瘤细胞的免疫监测和杀害，在抗肿瘤免疫中发挥关键作用[17]。目前，手术仍然是口腔癌治疗的主要手段。因此，研究口腔癌除手术治疗外的免疫治疗，对口腔癌患者更好的康复具有重要意义，免疫治疗也是当前研究的热点。相关研究表明，PD-1免疫治疗头颈部鳞状细胞癌有较大影响[18]。晚期头颈部鳞癌患者行PD1 抑制剂治疗,能够顺利完成治疗。Pembrolizumab（PD1 抑制剂）对治疗复发或转移性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）有效[19]。但是直到现在，PD1 免疫治疗对口腔癌患者T细胞免疫功能的影响尚不清楚。

因此,本研究拟通过流式细胞术检测口腔癌患者PD1 免疫治疗前后外周血T 淋巴细胞各个亚群的表达情况,探索肿瘤患者的免疫系统变化和T 淋巴细胞各表型在口腔癌症免疫疗法的预测功能,为口腔癌免疫治疗的临床应用提供理论依据。

材料和方法

1.患者和知情同意

本项目选取2019 年10 月～2020 年9 月在河北医科大学第四医院经术后病理证实的60 例口腔鳞癌患者作为研究对象。

纳入标准：18 岁＜年龄＜80 岁；入院前未进行抗肿瘤治疗；排除全身系统性疾病；临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期。

排除标准：年龄＜18 岁或者年龄＞80 岁；患有其他相关病症或已经进行相关治疗。

60例病人进行PD1免疫治疗。PD1是免疫检查点抑制剂（Immune-checkpoint inhibitors，ICIs）的一种。PD1 治疗采用静脉注射的方式进行，每次持续至少30 分钟。免疫治疗病人分别于治疗前两天及治疗后20天采取新鲜外周血1 ml，肝素抗凝。

术后2 周后合并化疗一起应用PD1 免疫治疗，每三周做一次，合并化疗六个周期，六个周期后单药应用直达两年。帕博利珠单抗的剂量为：200 mg 每3周一次。

试验经河北医科大学第四医院人体伦理委员会批准（伦理批号：2022KY408），并获得患者及其家属的书面同意。

2.免疫功能指标检测

使用流式细胞仪检测CD4+T 细胞和CD8+T 细胞在T 淋巴细胞中的百分比，计算CD4+T 细胞、CD8+T 细胞的比值。流式细胞仪-EPICS XL（美国BECKMAN-COULTER 公司)及其配套的计算机软件数据处理系统，SZ-1 型快速混匀器，超净工作台（美国BIOLOGICAL Safety Cabinets ClassII）。鼠抗人CD4-FITC、CD8-PE 单克隆抗体，红细胞裂解液，PBS等。

3.流式细胞仪检测条件及参数

Epics-XLII 型流式细胞仪产自美国Beckerman Coulter 公司，激发光源为15 mW 氩离子激光器，激发波长为488 nm。免疫荧光数据采用Expo32ADC进行分析，将仪器CV 值调整在2% 以内，flowcheckTMFlourpheres（10 μm）荧光微球（REF 6605359 Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835）作为检测前的标准样品。

4.ELISA法检测血液中IFN-γ和IL-2水平

采用人IFN-γ 试剂盒(货号：ab174443，公司：abcam，规格：1*96 test)和人IL-2 试剂盒（货号：PD2050, 公司：Bio-Techne China Co.Ltd.，规格：1*50 plates）。根据说明书进行实验流程操作。处理血液配制标准品，加样（标准品及样本），洗板，加检测抗体溶液，孵育，洗板，加酶溶液，孵育，洗板，加入TMB 底物，加入50 μl 终止液，立即450 nm 读数（双抗夹心法），有样本OD 值代入标曲中计算出浓度，结果以EXCEL形式发出。

5.统计学

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差表示。配对T检验实验组内的比较，采用方差分析进行实验组与对照组间的比较。P＜0.05被认为有统计学意义。

结 果

1.60例口腔癌患者的基线数据

共纳入60 例患者，其中男性患者32 例，女性患者28例；65岁以下患者34例，65岁以上（包含65岁）患者26例；肿瘤直径小于3 cm患者45例，大于或等于3 cm 患者15 例；Ⅲ期患者14 例，Ⅳ期患者46 例；无远处转移患者37 例，有远处转移患者23 例；无淋巴结受累患者30 例，淋巴结受累患者30 例；TNM 分期Ⅰ期患者6 例，Ⅱ期患者12 例，Ⅲ 期患者18 例，Ⅳ期患者24例（表1）。

表1 60例接受PD1治疗的口腔癌患者的基本信息

2.PD1治疗前后的免疫功能变化

在PD1 治疗后，口腔癌患者血液中IFN-γ 的含量显著升高，由0.347±0.112 升高为1.047±0.113（P＜0.001）；在PD1治疗后，口腔癌患者血液中IL-2 的含量显著升高，由1.916±0.657 升高为3.931±0.555（P＜0.001）；在PD1治疗后，口腔癌患者血液中CD4+T 细胞百分比的含量显著升高，由9.809±1.851 升高为23.720±3.873（P＜0.001）；在PD1 治疗后，口腔癌患者血液中CD8+T 细胞百分比的含量显著降低，由50.841±2.858 降 低 为13.095±2.871（P＜0.001）；在PD1 治疗后，口腔癌患者血液中CD4/CD8+T 细胞比例的含量显著升高，由0.194±0.038 升高为1.895±0.552（P＜0.001）。综上所见，口腔癌患者在接受PD1免疫治疗之后，患者的免疫功能明显提升，PD1治疗口腔癌效果显著（表2）。

表2 60例口腔癌患者在接受PD1治疗前后的免疫功能变化

表3 60例口腔癌患者在接受PD1治疗前后的临床效果

3.PD1治疗前后的临床效果对比

在PD1 治疗后，口腔癌患者吞咽困难的症状明显减轻，由治疗前的75.0%的吞咽困难发生率降低为11.7%（P＜0.001）。PD1治疗前的口腔黏膜炎的发生率为86.7%，PD1治疗后其发生率降低为10.0%（P＜0.001）。在PD1 治疗后，口腔癌患者口干的症状明显减轻，由治疗前的80.0%的发生率降低为15.0%（P＜0.001）。PD1 治疗前的疲劳的发生率为88.3%，PD1 治疗后其发生率降低为8.3%（P＜0.001）。PD1治疗前的头痛的发生率为78.3%，PD1 治疗后其发生率降低为18.3%（P＜0.001）。

讨 论

有研究表明，人体的抗肿瘤免疫主要是以细胞免疫为主，T 淋巴细胞为核心，由于T 淋巴细胞各亚型在抗肿瘤免疫中发挥的作用不同，所以各亚型T淋巴细胞在外周血中的分布反映了机体抗肿瘤免疫的情况[17]。研究得出，肝癌浸润淋巴细胞与癌旁组织相比，存在CD4/CD8 倒置、CD8 阳性T 细胞、NK 细胞和NKT 细胞含量减少的情况，提示主要抗肿瘤效应细胞含量降低。肝细胞癌与癌旁组织中的淋巴细胞基因表达存在差异[20]。研究得出，检测胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌患者的外周血T 细胞亚群对确定临床疗效和预后具有重要的临床意义[21]。胶质母细胞瘤细胞胞外酶CD73 表达量高，而CD39 表达量低；与外周血相比，胶质瘤浸润的CD4+T 淋巴细胞CD39 表达明显上调，而CD73 表达没有明显差异。胶质瘤的CD73 和CD4+T 淋巴细胞的CD39 可以协同作用，诱导腺苷介导的应答性T 细胞扩增的抑制[22]。胶质瘤组织中CD73 的表达与患者的预后相关，CD73 可能是胶质瘤新的免疫治疗靶点。CD4+和CD25+调节性T 细胞是最近才被认识的一类免疫调节细胞，因其强大的免疫调节作用被称为调节性T细胞（Treg）[23]。Treg源自于胸腺，发挥抑制性免疫调节的作用，持续表达IL-2Rα 链（CD25），具有免疫无能和免疫抑制性两种特征，可抑制自身免疫性疾病，诱导对移植物的免疫耐受。抑制抗肿瘤免疫应答的发生以及CD4+CD25-和CD8+T 细胞的激活和增殖。因此，自身免疫性疾病的治疗、肿瘤免疫治疗和移植耐受诱导等方面具有潜在的应用价值[24,25]。

当前，癌症免疫疗法着力于增强免疫系统对癌细胞的识别能力和杀伤能力，主要靠调控免疫系统的T 淋巴细胞，即通过激活人体自身的免疫系统，使其更为有效地进攻癌细胞[26]。目前主要有三种免疫治疗策略，分别为细胞免疫治疗（如树突细胞治疗）、细胞因子治疗（治疗肾细胞癌的白介素-2 等）和单克隆抗体治疗[27]。

其中，自身免疫细胞治疗技术是指将单个核细胞从患者自身的外周血和其他细胞中分离出来，经过专项实验室进行细胞的活化与增殖后，回输入患者体内，直接杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞，同时发挥调节和增强人体免疫功能的作用[28]。伴随自身免疫细胞治疗技术的发展，利用细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK 细胞）治疗恶性肿瘤的临床试验层出不穷，自体免疫细胞治疗技术快速高效且副作用小，相比其他治疗肿瘤技术的应用现状和发展，细胞免疫治疗技术是最有希望成为完全消灭癌细胞的肿瘤技术[29]。

本研究得出PD1免疫治疗可减轻口腔癌患者经过放化疗等治疗产生的巨大的毒副作用，避免手术切除对患者的身心健康造成的沉重打击，同时不破坏患者的免疫功能。有研究表明，可以通过阻断PD1 治疗晚期皮肤鳞状细胞癌[30]。本研究成果可有效帮助提高口腔癌患者的早期诊断、治疗效果，具有良好的预测作用，为口腔癌患者的临床治疗提供帮助，改善患者预后，同时可降低手术率，节约医疗费用。

结论：综上所述，运用PD1 免疫治疗口腔癌患者，治疗前后患者T 细胞免疫功能明显增强，对患者有一定的治疗效果，具有一定的临床应用价值与应用前景，为临床上应用针对口腔癌的免疫治疗提供理论依据。