Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL在慢性根尖周炎合并2型糖尿病根尖周组织中的表达

董文亮 喻 元 罗伟楷 杨慧霞 郭文卓 张 敬

慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis ,CAP）是一种常见的由根管内的微生物感染和宿主对根尖周组织的免疫反应引起的炎症反应性疾病[1]，临床上表现为根尖周结缔组织的破坏和骨吸收[2]。糖尿病是一种常见且严重危害人类健康的慢性内分泌代谢疾病[3]，其中2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上[4]。糖尿病与口腔健康密切相关，可导致多种口腔并发症，如牙周病、龋病、牙髓根尖周病等，糖尿病患者口腔疾病的发病率较正常人有明显增高[5～7]。

本研究通过对比Wnt3a/β-Catenin途径下OPG（osteoprotegerin）/RANKL（receptor activator of nuclear factor-κB ligand）/RANK（receptor activator of NFκB）系统在慢性根尖周炎及慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者根尖周组织中的表达是否存在差异，从而为探究糖尿病对慢性根尖周炎发生发展产生的影响提供依据。

材料与方法

1.研究对象及分组

利用随机数表法随机选择2019 年12 月～2021年12 月在宁夏医科大学总医院口腔医院拔牙且符合慢性根尖周炎诊断标准[8～10]的患者作为研究对象。对照组（20 例）：因正畸减数而拔除的健康牙齿牙周膜组织；实验组1（20 例）：慢性根尖周炎患者患牙根尖周病损软组织；实验组2（20 例）：慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者患牙根尖周病损软组织。实验方案已通过医院伦理委员会批准（2018-55），签署知情同意书。

CAP 纳入标准:①符合慢性根尖周炎诊断[8～10]，无治疗价值，拔牙指征明确的患牙；②能顺利获取患牙根尖周相连的病变软组织；③X 线片明确根尖周有骨质破坏，根尖周指数[9]（periapical index,PAI）分级≥3级。（图1）

图1 PAI指数的参考影像图及解剖图[9]

2型糖尿病纳入标准：①符合2型糖尿病诊断[4,5]且病程1 年以上、空腹血糖≤8.88 mmol/L 者；②无合并中风、心绞痛、心肌梗死、糖尿病肾病等严重糖尿病并发症。

排除标准：①牙周牙髓联合病变者；②除糖尿病外，全身患有其他系统性疾病者；③3 个月内有抗生素、非甾体类抗炎药等局部或全身用药史；④妊娠期患者及不能耐受拔牙手术者；⑤根管治疗中/曾有根管治疗史的患牙；⑥向患者说明研究目的后，不愿意参与、无法完成随访者。

2.标本采集与制备

根据实验分组拔出牙齿后，无菌刀片刮除对照组根尖区牙周膜、实验组根尖周病变组织，立即固定于10%中性缓冲福尔马林12～48 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明化，石蜡包埋，制备连续切片（厚度4μm）。

3.试剂与设备

一抗：Wnt3a 兔抗人多克隆抗体（Gene Tex，美国），β-Catenin，OPG，RANKL 兔抗人多克隆抗体（ABconal，中国武汉）；二抗：PV9000 试剂盒（鼠/兔，北京中杉金桥公司）；光学显微镜（Olympus，日本）；H&E 染色试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京九州柏林生物科技有限公司）。

4.H&E染色及计分

将各组样本按H&E 染色试剂盒说明书对病理连续切片完成H&E 染色。每样本随机选取3 个连续视野，显微镜下观察样本炎症浸润程度计分：轻度炎症（炎症细胞＜视野中细胞数量的1/3，计1 分）；中度炎症（视野中细胞数量的1/3≤炎症细胞≤视野中细胞数量的2/3，计2 分）；重度炎症（炎症细胞＞视野中细胞数量的2/3，计3分）[11]。

5.免疫组织化学染色及结果判定

切片脱蜡水化后，PBS洗3次（5分钟/次）。微波热修复抗原，室温冷却，过氧化酶阻断溶液室温下孵育10 分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。PBS 洗3次。每张切片滴加50 μL 正常非免疫动物血清（羊），37℃恒温箱封闭60 分钟，擦去多余血清。每张切片分别滴加一抗50 μL，4℃过夜（稀释比例1∶100）。室温复温60 分钟，PBS 洗3 次，滴加反应增强液50 μL，室温下孵育20 分钟。PBS 洗3 次。滴加50 μL 二抗（山羊抗兔IgG 聚合物）溶液，室温下孵育20 分钟。PBS 洗3 次。每张切片滴加100 μL DAB 显色，显微镜下掌握染色程度，自来水洗涤5分钟，苏木精复染、自来水冲洗、无水乙醇脱水干燥、二甲苯透明，中性树胶封片。

光镜下观察、拍照、结果判定：以染色强度结合阳性细胞百分比综合计分。①染色强度计分：以多数细胞呈现的染色特性（染色深浅与背景着色对比）计分，无着色为0 分；淡黄色为1 分；棕黄色为2 分；棕褐色为3 分[12]。②阳性细胞百分比计分：以（某类细胞）5 个400 倍视野的阳性细胞平均数计分，0～5%为0 分；6%～25%为1 分；26%～50%为2 分；51%～75%为3分；＞75%为4分。每张切片随机取5个400倍视野，每个视野进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分，二者乘积0 分为阴性（-）；1～4 分弱阳性（+）；5～8 分中度阳性（++）；9～12 分强阳性（+++）[12]。该结果由一名高年资病理医生进行双盲评分（Kappa 值＞0.81），观察3 次，取其均值作为各样本最终得分。

6.统计学处理

采用SPSS25.0 软件分析处理，计量资料（免疫组织化学染色结果）采用t检验，计数资料（H&E 染色炎症浸润程度计分）采用卡方检验，多组间比较采用单因素方差分析，其中两两样本之间相互比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有显著性。

结 果

1.H&E染色结果

光学显微镜下进行观察，牙周膜组织经组织病理分析为健康牙周膜组织，无明显炎性细胞浸润，为正常对照组（图2A）。实验组1与实验组2根尖周病损软组织中均可见大量炎症细胞浸润，根据其炎症浸润程度分为轻、中、重度炎症[11]（图2B、C、D）；对两组进行炎症浸润程度计分统计，结果显示慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组炎症浸润程度得分大于慢性根尖周炎组（χ2=8.139，P=0.0171＜0.05）（表1）。

表1 慢性根尖周炎组及慢性根尖周炎合并2型糖尿病组炎症浸润程度计分情况

图2 H&E染色炎症程度分级（×400）

2.免疫组织化学染色结果

对照组、实验组1、实验组2均检测到Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL 主要染色位于细胞质、细胞核中。对照组中Wnt3a 强阳性表达，β-Catenin未见表达，其余均少量表达（图3）。在实验组1、实验组2中，四种因子集中在中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞的细胞核、细胞质中表达（图4、5）。

图3 对照组牙周膜（成纤维细胞的细胞质）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫组织化学染色结果（×400）

图4 实验组1根尖周病损软组织（炎症细胞的细胞核、细胞质）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫组织化学染色结果（×400）

图5 实验组2根尖周病损软组织（炎症细胞的细胞核、细胞质）中Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的免疫组织化学染色结果（×400）

3.Wnt3a、β-Catenin在各组中的表达情况

Wnt3a、β-Catenin在对照组、实验组1、实验组2中阳性表达。Wnt3a 在实验组1 中的表达水平低于对照组，比较无统计学差异(P＞0.05)；在实验组2 中的表达水平高于对照组与实验组1，较对照组无统计学差异(P＞0.05)，与实验组1 比较有统计学差异(P＜0.05)。β-Catenin在实验组1、实验组2 中的表达水平均高于对照组且比较有统计学差异(P＜0.05)。（表2）

表2 Wnt3a、β-Catenin在各组中的表达水平（±s）

注：#与对照组比较，P＜0.05；*与实验组1比较，P＜0.05。

组别对照组实验组1实验组2 n 20 20 20 Wnt3a 10.37±2.41 8.37±4.17 12.83±3.95*β-Catenin 0±0 4.55±3.05#6.01±1.45#

4.OPG、RANKL、RANKL/OPG 在各组中的表达情况

OPG、RANKL 在各组中均阳性表达。OPG、RANKL、RANKL/OPG 在对照组、实验组1、实验组2中表达水平呈升高趋势，OPG 与RANKL/OPG 在各组间比较均有统计学差异(P＜0.05)，RANKL 在实验组1、实验组2的表达与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。（表3）

表3 OPG、RANKL在各组中的表达水平及RANKL/OPG 的比值变化（±s）

表3 OPG、RANKL在各组中的表达水平及RANKL/OPG 的比值变化（±s）

注：#与对照组比较，P＜0.05；*与实验组1比较，P＜0.05。

组别对照组实验组1实验组2 n 20 20 20 OPG 2.74±0.52 7.26±2.63#11.19±3.46#*RANKL 1.38±2.33 9.25±2.12#12.77.±1.74#RANKL/OPG 0.64±1.57 1.27±1.61#1.91±0.79#*

讨 论

慢性根尖周炎是根管内长期存在感染及病原刺激物而导致的根尖周围组织慢性炎症反应。局部且长期存在的炎症反应可以激活破骨细胞，进而启动骨吸收，且骨形成受阻，导致骨稳态的破坏[13,14]。Wnt3a/β-Catenin途径和OPG/RANKL/RANK 系统在骨代谢中起到重要作用[15,16]，在慢性根尖周炎及其他慢性疾病中的发生发展中均有表达[17～19]。它们参与调控成骨及破骨因子，并且与2 型糖尿病的胰岛素水平相关[20]。通过药物调控Wnt信号通路可能影响胰岛素水平，减少糖尿病相关并发症的发生[21,22]。在本研究中，H&E 染色结果表明在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组中炎症浸润的程度明显高于慢性根尖周炎组（P＜0.05），这与现有研究结果相一致，原因可能是糖尿病可直接影响免疫系统功能，导致愈合率下降和免疫功能延迟[23]。高水平的晚期糖基化终末产物会增加组织氧化应激并上调炎症反应[24]。临床研究也表明，糖尿病会降低根管治疗的成功率[25]，同时也会增加患者诊间急症的发生率以及病变的严重程度[23,26]，但具体机制还有待进一步的探索。

Wnt3a 是Wnt 信号通路中一个天然抑制剂，在炎症反应中可以通过抑制促炎因子来控制炎症反应[27]，通过Wnt3a/β-Catenin信号通路促进成骨细胞的形成[28]。本研究发现，Wnt3a 在对照组成纤维细胞中表达呈强阳性，β-Catenin未见明显表达。可能由于在对照组（健康牙周膜）中，Wnt3a 还参与其他信号通路的调节而未激活Wnt/β-Catenin通路[29]。而在慢性根尖周炎组与慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组中Wnt3a、β-Catenin均呈阳性表达，Wnt3a 在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组中表达量更高，差异有统计学意义（P＜0.05），与本研究前述的炎症浸润严重程度和Chen 等[30]在动物研究中的研究结果相符合。说明Wnt3a 借助Wnt信号通路在炎症反应中参与抑制促炎因子的产生，发挥抑制骨吸收、促进骨形成等作用[30]。

细胞质内的β-Catenin升高并转运至细胞核内，这是Wnt 经典信号通路活化的标志。本研究中，慢性根尖周炎组和慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组中β-Catenin的表达量均较对照组增高，且具有统计学差异（P＜0.05），与Wnt3a 的升高相一致，表明由于炎症刺激Wnt/β-Catenin通路被激活。值得注意的是，本研究中β-Catenin的表达在慢性根尖周炎合并2型糖尿病组中较慢性根尖周炎组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。分析其原因可能是机体高糖环境下对β-Catenin的抑制与重度炎症对β-Catenin的激活同时存在、相互抵消，进而导致其表达量无明显升高[17,31]，具体原因及机制需进一步实验进行深入研究。

RANKL和OPG在骨稳态中发挥着重要作用，破骨细胞的形成和激活受到RANKL/RANK/OPG 轴的重要调控[32]。Wnt/β-Catenin信号能够刺激成骨细胞上调OPG 表达，改变RANKL/OPG 的比值，抑制破骨细胞分化和活性，从而抑制骨吸收[15,32]。慢性根尖周炎是一种以根尖周牙槽骨破坏为主要表现的疾病，而糖尿病患者因其微血管病变及免疫系统的变化，对慢性根尖周炎局部骨稳态破坏产生影响。故认为RANKL/RANK/OPG 轴作为慢性根尖周炎合并2型糖尿病患者的研究切入点是有意义的。

本研究针对慢性根尖周炎组、慢性根尖周炎合并2 型糖尿病根尖周病变软组织切片中OPG、RANKL 在炎症细胞中表达情况进行分析，其表达水平均明显高于对照组，OPG 在慢性根尖周炎合并2型糖尿病组中表达水平明显高于对照组和慢性根尖周炎组，而RANKL 在慢性根尖周炎合并2 型糖尿病组中的表达水平高于慢性根尖周炎组，差异无统计学意义。与Moh、Mantovani 等人的研究结果相符合，即与正常血糖组相比，2 型糖尿病患者的血清OPG 水平显著增加，而RANKL 水平没有变化[20,33]。分析原因可能是糖尿病状态下RANKL/RANK/OPG轴启动，OPG 在炎症细胞中表达快速增高，OPG 对RANKL 信号的阻断，导致细胞中RANKL 升高不明显。虽然OPG 的上升会对破骨细胞的分化成熟起到抑制作用，但炎症的迁延不愈导致骨稳态持续破坏，骨吸收增加，同时糖尿病导致的局部微血管病变，也会导致炎症反应持续加重，并继发成骨细胞功能受损及活性降低，最终导致OPG 对破骨细胞活性抑制减弱，使慢性根尖周炎合并2 型糖尿病患者局部症状加重，根尖周骨质破坏增大。基于以上研究结果，我们猜想糖尿病及慢性根尖周炎在局部病变中通过Wnt/β-Catenin途径中的不同程度表达，调控OPG 及RANKL 的相关表达。这可能不仅与慢性根尖周炎的局部炎症刺激有关，同时也受糖尿病对全身机体免疫系统及白细胞趋化的影响[34]。

在实验方法上，本研究采用H&E 染色以及半定量的免疫组织化学方法对炎症浸润程度和Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL 的表达水平进行分析统计，主要考虑该方法具有特异性强、敏感性高、定位准确等特点，同时对组织样本的取材时间、组织量、储存条件等要求相对较低，操作较易。但结果受标本取材、视野选择、计分统计等方面的影响存在一定主观性、偶然性和局限性；检测目标蛋白表达量的结果精确度较qPCR、Western-Blot[11,16]等定量检测分析欠佳。提示笔者在未来进一步研究中利用动物模型控制标本取材的一致性，采用qPCR、Western-Blot等更为客观、精确、有效的方法检测目标蛋白的表达量。

综上所述，本研究结果表明，慢性根尖周炎根尖周组织炎症浸润程度及Wnt3a、β-Catenin、OPG、RANKL的表达水平与慢性根尖周炎患者是否患有2型糖尿病有关，提示2 型糖尿病在慢性根尖周炎的发生发展过程中起到一定作用。在局部病变中，2型糖尿病对慢性根尖周炎的影响表现在发病率的增高、并发症增加及成功率降低[25,26]。但是目前1型糖尿病及2 型糖尿病两种分型对局部病变是否会产生不同影响、对于慢性根尖周炎影响的通路及因子尚待进一步实验验证。