基于稳定同位素与矿质元素的普洱生茶产地溯源研究

王宇童 唐卿雁 邵金良 林 奇 杜丽娟

（1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所， 昆明 650205； 2. 云南省农业大学食品科学技术学院，昆明 650500）

普洱茶是云南省的地理标志性产品， 其是以云南大叶种晒青毛茶为原料， 经过鲜叶摊放、 杀青、揉捻、 解块、 日光干燥、 精制、 蒸压成型等工艺制成的茶叶。 普洱生茶的品质特征为外形色泽墨绿，香气清纯持久， 滋味浓厚回甘， 汤色绿黄清亮， 叶底肥厚黄绿[1]。 作为全球3 大天然饮料之一， 普洱茶不仅富含茶多酚、 咖啡碱、 氨基酸等多种营养成分， 还含有多种人体所需的矿质元素， 具有抗癌[2]、抗氧化[3]、 降血糖[4]、 降血脂[5]、 抗动脉粥样硬化[6]等多种功效。 普洱生茶具有更强的保护酒精性胃损伤[7]、 抗氧化活性、 降血糖血脂等功效[8]， 因而受到广大消费者的青睐。 但在普洱茶产业不断发展的同时， 一些商家采用产地造假、 以次充好、 品牌冒用等方式用劣质普洱茶冒充优质普洱茶进行售卖，不仅侵犯了消费者合法权益， 也阻碍了普洱茶产业的健康发展[9]。 因此， 解决普洱茶产地溯源问题亟不可待。

近年来， 农产品产地溯源发展迅速， 主要采用不同产地农产品的矿质元素、 有机元素、 稳定同位素等成分的差异结合化学计量法来进行农产品产地溯源。 矿质元素能很好地反映植物、 土壤间的迁移， ZHAO 和YANG[10]对稀土元素在茶叶地理溯源中的适宜性进行研究， 证明了茶叶中稀土元素含量与种源土壤存在显著相关性。 林昕等[11]基于稀土元素含量差异性对普洱茶古树茶和台地茶的产地和身份进行判别， 建立的判别模型回判验证正确率超过90%， 表明利用稀土元素指纹技术来判别普洱古树茶和台地茶的分类方法是可行的。 石伊凡等[12]利用有机元素及矿质元素对3 个产区的龙井茶进行溯源， 判别准确度达80%以上。 HUANG 等[13]通过测定罗汉果中14 种矿质元素结合线性判别分析和支持向量机建立溯源模型， 判别成功率达到100%。

同位素指纹与作物生长环境密切相关， 不同产地的作物稳定同位素比值会有所差异， 成为作物天然的身份标签[14]。 聂晶等[15]通过测定轻稳定同位素比值、 矿物元素含量对不同产地的绿茶进行识别分析， 总体判别准确度在95%以上。 BROMBIN 等[16]对意大利北部两个相距不到2 km 果园里苹果的多稳定同位素比值进行分析， 结果表明， 即使产品种植的距离只有几千米， 多稳定同位素分析也可以对其进行追溯。 张欣昕等[17]利用矿质元素及稳定同位素对马铃薯进行产地辨别， 结果表明， 矿质元素结合同位素比值进行产地判别分析的正确率高于矿质元素含量和同位素比值单独判别正确率。 LIANG等[18]通过测定碳 （C）、 氮 （N）、 氢 （H）、 氧 （O）的稳定同位素比值结合化学计量学方法， 对3 个三七产地的三七主根建立了产地判别模型， 不同计量方法对三七产地的正确判别率平均达到84.09%。

针对茶叶产地溯源研究， 现有研究多是通过茶叶本身所含的矿质元素、 稳定同位素、 化学成分等生化指标进行溯源分析， 而对土壤-茶叶中的稳定同位素的相关关系， 以及对产地溯源影响等方面的研究较少。 鉴于此， 本研究在基于以往的研究模式上， 将土壤、 茶叶中的稳定同位素进行相关性分析[19]。 通过测定茶样中稳定同位素C、 N 比值和矿质元素， 分析不同产地普洱茶中稳定同位素比值、矿质元素和有机成分的差异， 结合单因素方差分析、 正交偏最小二乘判别分析 （Orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA）、 判别分析和神经网络-多层感知器分析构建普洱茶在小尺度空间的产地溯源模型， 为云南高原特色地理标志产品普洱茶产地溯源技术提供理论基础。

一、 材料与方法

（一） 材料、 试剂与仪器

1.实验样品。 以云南省临沧市、 普洱市及西双版纳傣族自治州3 个地级市下的5 个县（区） 为普洱茶生茶溯源产地， 共采集30 份普洱茶生茶茶样及其对应产地的土壤样本 （见表1）。 普洱茶生茶样品及土壤样品均采集于2021 年11-12 月， 所有普洱茶生茶原料均为单一产地的古树茶， 没有多产地复配情况。 采集的土壤样品深度均为60 cm。

表1 采集地相关信息和样品数

2.实验试剂。 咖啡碱标准溶液、 茶氨酸标准溶液（纯度＞99%， 国家标准物质中心）； 硝酸（优级纯， 苏州晶瑞化学股份有限公司）； GBW100494 小麦成分分析标准物质（钢研纳克检测技术股份有限公司） ； 多元素标准溶液SGB -YYA23001I、SGB-YYA040011 （100 mg/L， 上海市计量测试技术研究院）； 元素混合溶液标准物质NIMRM5307（10 mg/L， 中国计量科学研究院）。

3. 实验仪器。 SPECORD210Plus 紫外可见分光光度计 （德国耶拿分析仪器股份公司）； U1timate 3000-IAP RQ 电感耦合等离子体质谱仪 （美国赛默飞世尔科技公司）； I-TOUCH 石墨炉消解仪（北京莱伯泰科公司）； OPTIMA8000 电感耦合等离子体发射光谱仪 （美国PE 公司）； EA-VisION 稳定同位素质谱仪 ［艾力蒙塔贸易 （上海） 有限公司］； DHG-9203A 电热鼓风干燥箱 （上海一恒科技有限公司）； TGL-10B 高速台式离心机 （上海安亭科学仪器厂）。

4.样品前处理。 将采集到的普洱茶样品用粉碎机粉碎均匀过筛， 75℃烘干至恒重， 放入密封袋，密封避光保存。

（二） 稳定同位素比值的测定参考胡玲等[20]的方法， 取约0.8 mg 待测样品包入锡纸杯， 放置在同位素质谱仪自动进盘中， C、 N、 硫（S） 元素通过高温燃烧后再经过铜丝还原生成CO2、 N2和SO2， 之后载入质谱检测。 稳定同位素质谱仪具体参数： 燃烧管（Comb tube） 温度为1150℃， 还原管 （Reduct tube） 温度为850℃， TCD 流速为230 mL/min， 氦气流速为230 mL/min。

（三） 矿质元素的测定

1.样品消解。 采用硝酸结合高氯酸对样品、 国家标准物质GBW100494 及试剂空白进行消解。 消解过程为称取0.3 g 样品 （精确到0.001 g） 于聚四氟乙烯消解管， 加入10 mL 硝酸和1 mL 高氯酸，加盖放置于石墨炉消解仪中， 按设定的温度分阶段消解。 消解结束后加入0.65 mL 硝酸 （1∶1，V∶V）， 倒入25 mL 容量瓶中， 使用超纯水清洗3次消解管， 倒入容量瓶， 定容至25 mL。

2. 微量元素的测定。 参考胡玲等[20]的方法， 使用电感耦合等离子体质谱仪进行测定。 工作参数：分析模式为碰撞反应池； 蠕动泵清洗时间和提升时间分别为20 s 和30 s； 射频功率1500 W； 等离子体气流量、 载气流量、 辅助气流量、 氦气流量分别为15、 0.8、 1.2 L/min 和4.5 mL/min； 采样深度9.0 mm， 采样模式为Spectrum； 重复采集数据3 次。

3. 常量元素的测定。 参考魏新军等[21]的方法，使用电感耦合等离子体发射光谱仪进行测定。 工作参数： 功率1300 W； 等离子体流量、 辅助气流量和雾化气气体流量分别为20、 1 和0.5 L/min； 重复采集数据3 次。

（四） 有机成分的测定

1.游离氨基酸的测定。 游离氨基酸总量的测定参照GB/T 8314-2013 《茶 游离氨基酸总量的测定》。

2. 茶多酚的测定。 茶多酚含量测定参照GB/T 8313-2018 《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。

3. 咖啡碱的测定。 咖啡碱含量测定参照GB/T 8312-2013 《茶 咖啡碱测定》。

（五） 数据处理数据均为3 次重复实验结果，采用SPSS 26.0 统计分析软件进行单因素方差分析（选用Duncan 进行多重比较）、 Fisher 判别分析和多层感知器分析； 采用SIMCA 14.1 统计分析软件进行OPLS-DA； 作图采用Origin 2022。

二、 结果与分析

（一） 稳定同位素比值测定结果分析

1.稳定同位素比值结果分析。 对5 个产地普洱茶生茶和对应土壤的稳定同位素比值进行单因素方差分析， 结果显示， 茶叶中δ15N、 δ13C 值均存在组间显著差异 （p＜0.05）（见表2）。 原因可能是δ15N的组成差异不仅仅受到生态环境的影响， 很大程度上还受不同类型的肥料影响[20]， 而植物中的碳同位素会受到不同气候和环境因子的影响[21]， 因此不同产地茶叶中的δ15N、 δ13C 值存在一定的差异性。土壤中的δ34S、 δ15N、 δ13C 也存在组间显著差异性（p＜0.05）。

表2 不同产地普洱生茶、 土壤中的稳定同位素比值（‰）

2.稳定同位素比值相关性分析。 对茶叶、 土壤中的稳定同位素比值进行Pearson 相关性分析， 结果表明， 茶样中δ13C 值与土壤中δ13C 值存在极显著负相关性 （见图1）， 与土壤中δ34S 值存在显著的正相关。 茶叶中δ15N 值与土壤中δ15N 值存在极显著正相关， 与土壤中δ13C 值存在显著正相关，与土壤中δ34S 值存在极显著的负相关性。 原因可能是茶叶中的氮主要来源于根部吸收的土壤养分， 不同外源氮的同位素会直接影响茶树体内氮同位素的变化[22]。 同时， 土壤中δ15N、 δ13C、 δ34S 值也存在一定相关性， 土壤中δ15N 值与土壤中δ13C 值存在极显著正相关， 而土壤中δ34S 值与土壤中δ15N、δ13C 值存极显著负相关。 这说明茶叶与土壤间的同位素比值存在一定的相关性。

图1 不同产地普洱生茶及对应土壤中稳定同位素比值的相关性热图

（二） 矿质元素测定结果分析

1.常量元素结果分析。 比较各产区普洱生茶的6 种常量元素 （Ca、 K、 Mg、 P、 Na、 S）， 其中K、P、 Na 元素不存在显著差异， Ca、 Mg、 S 元素均存在组间显著性差异 （p＜0.05）（见表3）。 双江自治县普洱生茶的Ca、 Mg、 S 元素含量均低于5 地的平均值； 临翔区产地普洱生茶的Ca 含量明显低于其他4 地； 澜沧自治县普洱生茶的Ca、 Mg 含量均高于其余4 地， 勐海县、 勐腊县两地生茶的S 含量均值分别为2149、 2011 mg/kg， 高于其他3 地。

表3 不同产地普洱生茶中的常量元素含量 （mg/kg）

2. 微量元素结果分析。 比较不同产区茶样的10 种微量元素 （Se、 Mo、 Mn、 Sn、 Cu、 Fe、 Zn、Ba、 Al、 Kr） 含量， 除了Mo 不存在显著差异性，其余9 种微量元素 （Se、 Mn、 Sn、 Cu、 Fe、 Zn、Ba、 Al、 Kr） 含量均具有组间显著差异性（p＜0.05）（见表4）。 其中， 双江自治县产地茶样中Mn、Zn 含量明显低于其余4 地； 临翔区产地茶样中Mn、 Fe、 Al 含量明显高于其余4 地； 勐海县产地茶样中的Sn、 Ba 明显高于其余4 地； 勐腊县产地茶样中Se、 Mo、 Fe、 Ba、 Al 含量低于其余4 地。

表4 不同产地普洱生茶中的微量元素含量（mg/kg）

3.稀土元素结果分析。 对不同产地普洱生茶的16 种稀土元素含量进行比较， 结果显示， 不同产地茶样中16 种稀土元素含量存在组间显著差异 （p＜0.05）（见表5）， 表明稀土元素与不同产地存在一定的相关性。

表5 不同产地普洱生茶中的稀土元素含量 （μg/kg）

（三） 有机成分测定结果分析不同产地茶样中的茶多酚、 游离氨基酸、 咖啡碱含量均呈现组间显著性差异（p＜0.05）（见表6）。 其中， 勐腊县产地普洱生茶茶多酚含量低于其他4 个产地； 临翔区产地普洱生茶游离氨基酸含量明显均低于其他4 个产地； 5 个产地的茶样中， 勐海县的咖啡碱平均含量最高， 澜沧自治县的游离氨基酸平均含量最高。 这说明不同产地有机成分含量具有一定差异， 对产地溯源也具有一定的作用。

表6 不同产地普洱生茶中的有机成分含量（%）

（四）普洱生茶产地溯源分析

1.OPLS-DA。 将稳定同位素及矿质元素在单因素方差分析结果中存在显著差异的30 项指标进行OPLS-DA， 结果显示， 自变量拟合指数R2x＝0.894， 因变量拟合指数R2y＝0.842， 模型预测指数Q2＝0.747， 即对5 个不同产地茶样的预测率为74.7%，R2和Q2均大于0.5 表示模型拟合的结果可接受[23]。 OPLS-DA 得分图 （见图2） 中可以看出不同产地的样品分离效果一般， 临翔区和勐腊县茶样相对聚集， 可被明显区分开； 双江自治县与澜沧自治县样品虽然能被区分开， 但相距很短； 勐海县茶样较为分散， 有个别茶样靠近双江自治县茶样。 对OPLS-DA 模型进行200 次置换检验， 结果显示，Q2回归线与纵轴的相交点小于0 （见图3）， 说明构建的OPLS-DA 模型没有出现过拟合，模型的验证有效。 变量重要性投影 （Variable importance in projection， VIP） 值见图4， VIP 值越大代表对于区分组别的贡献越大， 因为所有变量VIP值的平方和为1， 所以常将VIP＞1 的指标作为判定区分组别的主要差异指标[24]。 在该模型中共有11 个指标 （Cu、 Fe、 Mn、 Ca、 Mg、 Zn、 Al、 S、 Kr、Ce、 δ13C） 的VIP 值大于1， 表示在此模型中这11种成分是区分不同产地普洱生茶的差异物质。

图2 不同产地普洱生茶样品的OPLS－DA 得分图

图3 OPLS－DA 模型200 次迭代计算验证图

图4 存在显著组间差异的30 项指标的VIP 图

2.判别分析。 根据指标（p＜0.05、 VIP 值＞1 的标准， 将上述筛选出的11 种差异物质使用SPSS进行判别分析， 得到4 个判别方程式［见公式（1）～（4）]和5 个组质心函数（见表7）。

表7 组质心函数

以第1、 第2 判别函数为横纵坐标， 根据组质心处的函数绘制散点图 （见图5）， 可以看出5 个产地的茶样聚集性效果较好， 只有双江自治县和勐海县出现轻微重叠的现象， 但双江自治县、 澜沧自治县、 勐海县3 个产地组质心距离较为相近， 勐腊县和临翔区能够与其他产区完全分开。 利用11 个指标所建立的普洱生茶判别模型对5 个产区的茶样进行归类， 并结合回判验证和留一交叉验证， 结果见表8。 从初始分类结果来看， 所建模型对90.0%的原始已分组生茶样品进行了正确分类， 并且对90.0%的交叉验证已分组个案进行了正确分类。

图5 分类散点图

表8 判别分析检验

3. 神经网络-多层感知器分析。 根据指标p＜0.05、 VIP 值＞1 的标准， 将筛选出的11 种差异物质进行神经网络-多层感知器溯源建模。 将11 项指标设置为模型的输入层， 输出层由5 个产地构成， 以70%随机样品作为训练样本， 30%随机样本作为检验样本， 结果见表9。 结果显示， 训练集与测试集正确率总和为200.0%， 训练集的分类正确率为100.0%， 测试集分类正确率为100.0%。

表9 多层感知器分类正确率

三、 结论

本研究通过单因素方差分析5 个产地普洱生茶样品中N、 C 稳定同位素比值、 32 种矿质元素、 3种有机成分含量共37 项指标， 发现不同产地茶样间的稳定同位素、 矿质元素、 有机成分存在一定的差异， 筛选出茶样中具有产地差异且VIP 值大于1的11 种差异物质 （Cu、 Fe、 Mn、 Ca、 Mg、 Zn、Al、 S、 Kr、 Ce、 δ13C）， 构成普洱生茶产地溯源信息指标。 结合判别分析、 神经网络-多层感知器分析建立了双江自治县、 临翔区、 澜沧自治县、 勐海县、 勐腊县5 个产区的普洱生茶溯源模型， 其中基于神经网络-多层感知器的溯源模型溯源结果最优， 训练集和测试集分类正确率均达到100%； 而判别分析构建的模型判别正确率及交叉验证率均为90%。 本研究为普洱生茶在小尺度空间溯源提供了一定的理论依据。

同时， 本研究在土壤-茶叶的稳定同位素相关性分析中， 证实了不同产地的茶样和土壤稳定同位素比值存在一定的相关性。 本研究收集的样品量不足以代表当地所有普洱茶。 由于不同产地普洱茶生茶的稳定同位素、 矿质元素、 有机元素可能受到水源、 空气等因素影响， 还需进一步控制变量并增加实验样本， 这样实验的结果将更加准确和完善。