脂联素受体在肥胖相关结肠炎相关性癌小鼠结直肠组织中的表达情况▲

王宇欣 郭 怡 王 冲

(陕西中医药大学1 公共卫生学院,2 医学科研实验中心,陕西省咸阳市 712046)

肥胖是当代社会面临的严重健康问题之一,与多种癌症的发生发展密切相关[1]。结肠炎相关性癌(colitis-associated cancer,CAC)是以肠道慢性炎症为基础的癌变,结肠炎症持续存在并向癌症转化的动态演进过程即为结肠炎-癌转化。近年来,有学者发现肥胖与结肠炎-癌转化之间存在着复杂的关联。肥胖引起的微生物群组成和干细胞调节的改变可以促进CAC的发生[2]。Wunderlich等[3]的研究结果显示,与正常饲料喂养的结肠炎小鼠相比,高脂饲料喂养所致肥胖的结肠炎小鼠的异常增生性肿瘤发生率升高,且小鼠结直肠组织中炎症细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子、IL-1β和IL-10的表达水平升高,表明肥胖加剧了结肠炎症,损害了肠道屏障功能,促进CAC的发生。

脂联素是一种由脂肪细胞分泌的激素,被认为对能量代谢、炎症调节和肿瘤发生起着重要作用[4]。血清中的脂联素水平与内脏肥胖的发生呈负相关,并具有抗糖尿病、抗炎和抗动脉粥样硬化的特性[5-6]。脂联素主要通过与脂联素受体(adiponectin receptor,AdipoR)1和AdipoR2的结合而发挥作用[7]。脂联素及其受体参与调控肿瘤的生长和进展过程。有学者发现,脂联素通过调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等关键过程,对结肠癌的发生、发展产生双重影响[8]。然而,在肥胖状态下,AdipoR在结肠炎-癌转化过程中的作用还不清楚。因此,本研究首先建立肥胖小鼠模型,然后通过腹腔注射氧化偶氮甲烷联合饮用2%硫酸葡聚糖钠盐的方法[9-11]建立CAC模型,探究AdipoR在肥胖相关CAC小鼠结直肠组织中的表达情况及其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 氧化偶氮甲烷购自Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(批号:25843-45-2),葡聚糖硫酸钠购自MP Biomedicals Co.,Ltd.(批号:100GM),高脂饲料购自成都达硕实验动物有限公司,RNAiso Plus、反转录试剂盒、PCR检测试剂盒均购自TaKaRa公司(批号分别为9108、DRR036A、DRR081AP),兔抗AdipoR1多克隆抗体购自GenXspan公司(批号:GXP10744),山羊抗AdipoR2多克隆抗体、生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)购自Abcam公司(批号分别为ab77612、ab6789),β-actin抗体购自Merck Millipore公司(批号:MABT825),RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、二喹啉甲酸蛋白浓度检测试剂盒、特超敏ECL化学发光即用型底物(武汉博士德生物工程有限公司,批号分别为AR0102、AR1178、AR0146、AR1197)。显微镜购自OLYMPUS公司(型号:CX21),高速台式冷冻离心机购自Eppendorf公司(型号:5417R),组织匀浆器购自IKA公司(型号:T10basic),超微量分光光度计购自Thermo Fisher Scientific公司(型号:NanoDrop 2000c),PCR仪购自Applied Biosystems公司(型号:ABI-7500),电泳仪、电泳电源购自Bio-Rad公司(型号分别为1658004、1645070),凝胶成像系统购自ProteinSimple公司(型号:FC3)。

1.2 肥胖小鼠模型的建立 34只无特定病原体级健康雌性昆明小鼠购自成都达硕实验动物有限公司[动物合格证号:SCXK(川)2020-030],4周龄,体重20～30 g。饲养环境温度为20 ℃～25 ℃,昼夜明暗交替(日光灯照明)。给予普通饲料适应喂养(自由饮水)1周后,按空腹体重采用随机数字表法选取14只小鼠设为正常组,继续饲喂普通饲料。给予其余20只小鼠饲喂高脂饲料,喂养4周,其间每周测定1次空腹体重,4周后,选取空腹体重高出正常组平均体重20%的10只小鼠作为造模成功的肥胖小鼠(肥胖模型组)。

1.3 结肠炎-癌转化小鼠模型的建立 采用随机数字表法将14只正常组小鼠随机分为空白对照组(6只)、空白模型组(8只)。给予空白模型组和肥胖模型组小鼠一次性腹腔注射氧化偶氮甲烷溶液(使用PBS配置浓度为1 mg/mL的溶液,给药剂量为12 mg/kg),腹腔注射后给予自由饮水(灭菌蒸馏水),1周后饮水中添加2%硫酸葡聚糖钠盐,持续给药1周后正常饮水(期间饮用灭菌蒸馏水)2周,此为1个循环,共进行3次循环,于实验结束时处死小鼠。给予空白对照组小鼠一次性腹腔注射同体积无菌生理盐水,之后连续饮用灭菌蒸馏水。所有小鼠饲养条件完全相同。整个造模过程中,继续给予空白对照组、空白模型组小鼠饲喂普通饲料,继续给予肥胖模型组小鼠饲喂高脂饲料;每天观察小鼠进水量、排便形状、便血情况和脱肛情况,每周记录小鼠体重变化。

1.4 肠道组织的收集 造模结束后,称量所有小鼠体重,通过腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,待麻醉成功后将小鼠四肢固定于解剖板上,沿腹中线纵行剖开腹腔。钝性分离结肠和远端回肠,冰浴截取从肛门处至盲肠末端的全部结直肠组织,用预冷的生理盐水漂洗干净,沿着结肠纵轴剖开,去除结肠回盲部,漂净肠内容物,用1%阿尔新蓝染色结肠黏膜表面后拍照记录,使用ImageJ软件记录每只小鼠结直肠肿瘤的数目。随后将结直肠组织分为两部分:将一部分组织放入EP管置于液氮冻存,随后转入-80 ℃冰箱中保存,用于后续分子生物学实验;将另一部分组织翻卷成年轮状后置于4%多聚甲醛中固定,用于后续HE染色。

1.5 肠道组织病理切片制作及HE染色 将结直肠组织置于4%甲醛溶液中固定后,用手术钳修剪多余组织后放入包埋盒中,使用70%乙醇清洗两次后过夜浸泡。第2天依次使用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水10 min,将脱水后的组织置于无水乙醇与二甲苯的混合液(体积比为1∶1)中进行透明。于55 ℃的烘箱中溶解石蜡后,将组织浸于54 ℃～56 ℃的石蜡中50 min,浸蜡完成后在石蜡包埋机中进行包埋,将包埋好的蜡块置于4℃冷藏过夜,第2天将蜡块切片后置于55 ℃烤箱中烤片1 h,二甲苯脱蜡复水,将切片依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、双蒸水中冲洗10 min以脱蜡复水。在切片上滴加苏木素染色5 min,流水清洗10 min,伊红染色5 min。再次对染色后的切片进行脱水后,使用中性树脂封片,在显微镜下观察拍照。

1.6 实时荧光定量PCR检测结直肠组织AdipoR1、AdipoR2的mRNA表达水平 按照RNAiso Plus说明书提取结直肠组织总RNA,并使用超微量分光光度计检测260 nm、280 nm处的A值,以A260/280值来评估RNA的纯度,确保A260/280值介于1.8～2.2之间。采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据NCBI数据库公布的小鼠AdipoR1、AdipoR2基因序列,应用Primer 3.0软件设计引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH为内参基因。引物序列见表1。采用实时PCR仪及PCR检测试剂盒进行实时PCR 检测。设置反应体系为20 μL,包括TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA模板4 μL、RNase-free ddH2O 4 μL。反应条件:95 ℃预变性5 s;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。每个样本设置2个复孔,所有基因检测均重复3次,并取其平均值。采用2-ΔΔCt法分析目的基因mRNA相对表达水平。

表1 引物序列

1.7 Western blot检测结直肠组织AdipoR1、AdipoR2的蛋白表达水平 取小鼠结直肠组织按100∶1的比例加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂,匀浆机充分研磨后冰上裂解30 min,12 000 r/min离心10 min后取上清液。采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度后,加入RIPA裂解液和5×上样缓冲液统一浓度,水浴锅100 ℃变性10 min,经SDS-PAGE分离等量蛋白。电泳结束后,将蛋白转移到PVDF膜上,然后在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h,然后用兔抗AdipoR1多克隆抗体(1∶1 000)、山羊抗AdipoR2多克隆抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶5 000)在4 ℃下孵育PVDF膜过夜,使用TBST洗膜3次,10 min/次,然后滴加生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(1∶5 000),室温孵育1 h。使用ECL分析试剂显影,经曝光后,使用ImageJ软件对条带进行扫描分析。每个样本设置2个复孔,所有蛋白样品检测至少重复4次,并取其平均值。

1.8 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,服从正态分布且方差齐的计量资料,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠一般状态 空白对照组小鼠精神饱满,反应灵敏,行动灵活自如,毛发光亮,食水摄入正常,大便呈现黄褐色颗粒状,无腹泻或便血等表现。空白模型组和肥胖模型组小鼠普遍出现体重减轻、毛发晦暗及倦怠少动的现象,并且出现不同程度的腹泻、便血、脱肛等情况。

2.2 3组小鼠的死亡和成瘤情况比较 在造模过程中,空白对照组死亡小鼠和成瘤小鼠均为0只,死亡比例及成瘤率均为0;空白模型组死亡小鼠1只、成瘤小鼠5只,每只肿瘤数量0～6个,死亡比例为12.5%(1/8),成瘤率为71.4%(5/7);肥胖模型组死亡小鼠6只、成瘤小鼠4只,每只肿瘤数量5～6个,死亡比例为60.0%(6/10),成瘤率为100.0%(4/4)。由于每组的小鼠数量较少,故仅对小鼠存活情况进行描述性分析。此外,为保证实验数据的一致性,本实验以肥胖模型组小鼠的存活数量4只为标准,在空白对照组小鼠和空白模型组成瘤小鼠中,采用随机数字表法各选取4只进行实时荧光定量PCR和Western blot实验。

2.3 3组小鼠结直肠组织的大体形态 空白对照组小鼠结直肠组织结构正常;空白模型组小鼠结肠长度缩短,结肠黏膜变薄,肠腔内可见深黑色粪便,肠壁可见血丝,部分小鼠结肠远端出现数量不等的肿瘤;与空白模型组小鼠相比,肥胖模型组小鼠结肠呈短粗状,粪便堵塞肠腔,肠壁增厚显著,充血较为严重,结肠远端有多个肉眼可见的大小不一、个数不等的肿瘤,并且肿瘤数量明显增加,见图1。

空白对照组 空白模型组 肥胖模型组

2.4 3组小鼠结直肠组织病理学形态的比较 空白对照组小鼠的结肠肌层和黏膜层形态完整,且隐窝排列整齐,未见炎性细胞浸润,无病变情况。与空白对照组相比,空白模型组与肥胖模型组小鼠的结肠壁厚度增加,镜下黏膜层及黏膜下层出现广泛的炎症细胞浸润,腺体组织结构紊乱、形状不规则,且可观察到腺管样结构,具有组织异型性。与空白模型组相比,肥胖模型组小鼠的结肠上皮损伤更严重,炎症反应更明显,杯状细胞显著减少,上皮细胞核极性破坏,大多数腺体结构扭曲变形,细胞核增大深染,部分小鼠的肿瘤侵犯黏膜下层及肌层,见图2。

空白对照组 空白模型组 肥胖模型组

2.5 3组小鼠结直肠组织中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表达情况 与空白对照组相比,空白模型组和肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表达水平升高(P<0.05);与空白模型组相比,肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR2的mRNA表达水平升高(P<0.05),见表2。

表2 3组小鼠结直肠组织中AdipoR1和AdipoR2的mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.6 3组小鼠结直肠组织中AdipoR1、AdipoR2的蛋白表达情况 与空白对照组相比,空白模型组小鼠结直肠组织中AdipoR2的蛋白表达水平、肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR1及AdipoR2的蛋白表达水平升高(P<0.05);与空白模型组相比,肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR1的蛋白表达水平升高(P<0.05),见图3和表3。

图3 3组小鼠结直肠组织中AdipoR1、AdipoR2蛋白表达的电泳图

表3 3组小鼠结直肠组织中AdipoR1和AdipoR2的蛋白相对表达水平比较(x±s)

3 讨 论

CAC是基于肠道慢性炎症发展而来的一种癌变类型[12-13]。结肠炎症的持续存在并逐渐演进至癌症是结肠炎-癌转化的动态过程。结肠炎与结肠癌之间的相互关系及其对结肠癌治疗的影响已成为防治结肠癌领域的研究热点和挑战。

肥胖与多种健康问题和慢性疾病密切相关,如癌症、脂肪肝和阿尔茨海默病等[14]。越来越多的研究表明,肥胖已经成为CAC发生的一个重要危险因素。肥胖本身为一种炎症状态,可对肠道环境和机体免疫功能产生不利影响[15],从而增加结肠炎和结肠癌的患病风险[16]。肥胖与结肠炎-癌转化之间存在多个复杂的相互作用机制。肥胖导致脂肪组织增加,并释放出多种脂肪因子和炎症因子,如脂联素、肿瘤坏死因子-α[17]和IL-6[18]等,这些因子可以直接或间接地影响结直肠组织的炎症反应和肿瘤发展。Tabuso等[19]报告驻留脂肪细胞与结肠癌细胞之间的相互作用,可促进肿瘤微环境的形成和结肠癌的发展,具体表现为在结肠癌中驻留脂肪细胞表现为激活表型,导致促肿瘤因子的增加,从而促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和新血管生成等过程。Bähr等[20]的研究表明,肥胖大鼠血浆中的IL-1水平较高而IL-10水平较低,这可能导致自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性受到抑制,从而增加肥胖大鼠结肠癌的发生率。此外,自然杀伤细胞数量减少和功能受损可能是肥胖人群结肠癌发病风险增高的原因之一。在本研究中,空白模型组和肥胖模型组小鼠的毛发稀疏,光泽少,活动明显减少,出现不同程度的腹泻、脱肛、便血等表现;空白模型组和肥胖模型组小鼠的结肠远端出现数量不等的肿瘤,肠黏膜炎症反应明显,结肠黏膜腺体结构紊乱,且肥胖模型组小鼠的结肠肿瘤数量更多,结肠上皮损伤更严重,炎症反应更明显。这提示成功建立了CAC小鼠模型及肥胖相关CAC小鼠模型,且肥胖相关CAC小鼠模型表现出更严重的肠道症状,由此推测肥胖因素可能加剧了CAC的发展,但关于肥胖与CAC之间的分子机制仍需进一步研究和阐明。

脂联素是一种由脂肪组织分泌的激素,被认为对能量代谢、炎症调节和肿瘤发生起着重要作用[21],并且具有抗动脉粥样硬化、抗炎、胰岛素增敏的特性[22]。AdipoR是脂联素信号传导的关键组成部分,它包括AdipoR1和AdipoR2,这两种受体分布在不同类型的组织和细胞中[23]。脂联素通过与AdipoR结合来实现信号传导和生物学效应,抑制与肿瘤发生相关的生物过程[22]。既往研究表明,AdipoR1和AdipoR2在小鼠结肠、盲肠和骨骼肌中大量表达,并且同样也在人肠上皮细胞系Caco-2、T-84和SW-480中表达[24]。Peng等[18]制备了猪AdipoR1转基因小鼠(pAdipoR1小鼠)并进一步诱导建立结肠炎小鼠模型,结果显示AdipoR1的长期过表达加剧了小鼠的结肠炎,并增强巨噬细胞和结肠上皮细胞中促炎因子的表达。AdipoR1和AdipoR2在转移性或局部晚期乳腺癌患者的树突状细胞中富集,AdipoR1、AdipoR2可能分别通过激活单磷酸腺苷酸激活蛋白激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体和环氧合酶2信号通路,进而减弱树突状细胞的抗肿瘤作用[25]。目前的研究多聚焦于探究AdipoR1和AdipoR2对结直肠癌预后的影响。例如,一项基于369例结直肠癌患者的研究显示,AdipoR1的过表达与结直肠癌的总体生存率较低相关[26];Barresi等[27]报告AdipoR1和AdipoR2的表达水平与结直肠癌患者的总生存率呈显著相关性。然而AdipoR1和AdipoR2对肥胖相关CAC的作用机制尚不明确。因此,我们检测了AdipoR1和AdipoR2在CAC小鼠和肥胖相关CAC小鼠结直肠组织中的表达情况。结果显示,与空白对照组相比,空白模型组和肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表达水平升高,空白模型组小鼠结直肠组织中AdipoR2的蛋白表达水平、肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR1及AdipoR2的蛋白表达水平升高(P<0.05);与空白模型组相比,肥胖模型组小鼠结直肠组织中AdipoR2的mRNA表达水平、AdipoR1的蛋白表达水平升高(P<0.05)。这表明,在CAC小鼠中脂联素受体AdipoR1和AdipoR2的基因和/或蛋白表达上调,且肥胖状态加重这一现象。

总之,脂联素受体AdipoR1和AdipoR2与肥胖相关CAC密切关联,两者有望成为治疗肥胖相关CAC的新靶点。然而,脂联素受体在CAC和肥胖相关CAC中的作用机制,以及其是否可作为结肠癌的临床诊断标志物,仍需要进一步研究证实。