IL-15 转染人CIK 细胞对HT-29 的杀瘤效果探究

2023-11-18王柏涛梁宇堃王丙萍杨超旗高艳伟b

生物医学工程与临床 2023年5期

王柏涛，梁宇堃，王丙萍，杨超旗，高艳伟b

作为较为多见的消化系统恶性肿瘤，结肠癌（colorectal cancer，CRC）的致死率已跃居癌症死亡率前列[1]，中国新近CRC 发病人数显现迅速上涨态势。当前虽已对CRC 的发生发展及其浸润、转移机制有了一定认知，但由于早期症状多不典型，大多发现时已属晚期[2]。手术、化学治疗和放射治疗为CRC 主要治疗方式，但此类疗法复发率及病死率较高，且预后差。作为肿瘤治疗的第4 种模式，免疫治疗现已成为多数恶性肿瘤的标准疗法[3]，且过继性细胞免疫疗法已在治疗某些血液系统疾病中获得较好疗效[4]。

具备自然杀伤T 细胞表型特性，同时多细胞因子参与调控所致的细胞因子诱导杀伤（cytokine-induced killer，CIK）细胞，多数学者基于其增殖速度、抗瘤杀瘤等方面的优越性[5]，CIK 疗法已然变成肿瘤免疫学研究的关键所在。白细胞介素（interleukin，IL）15（IL-15）已被证实可显著增强CIK 细胞的体外细胞毒性[6]。笔者实验对IL-15 基因（IL-15）转染人CIK 细胞治疗CRC 进行初步探究，评估其对人CRC 细胞株HT-29细胞的杀伤效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验病毒、细胞与血液样本

携带IL-15的慢病毒上清液（GeneChem Company，中国上海）。

人CRC 株HT-29 由内蒙古自治区肿瘤研究所供给。

静脉采集健康成年人血液标本15 mL。取得患者知情同意并签署知情同意书（编号：20220709）。

1.1.2 主要试剂

达氏修正依氏培养液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco，美国）；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）-白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）3、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）-CD56、鼠抗人FITC-IgG （BD，美国）；GT-551（TaKaRa，日本）；KBM-551 培养液（康宁生命，中国）；CD3 单抗（苏州VANVO，中国）；干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）、IL-1α、IL-2（R ＆ D，美国）； CCK-8（北京沃比森，中国）；细胞因子IL-15、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IFN-γ 酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（BD，美国）。

1.1.3 仪器与设备

离心管、细胞培养皿（Costar，美国）；FACSCalibur流式细胞仪(BD，美国) ；CO2培养箱（赛默飞，美国）；超净台（AIRTECH，中国）；荧光显微镜（徕卡，德国）；恒温水浴锅（RADOBIO，中国）；电子天平（METTLER TOLEDO，中国）；多量程移液器（Brand，德国）；-80 ℃超低温冰箱（REVCO，美国）；酶标仪（北京PERLONG，中国）。

1.2 方法

1.2.1 CIK 细胞培养

将血液标本15 mL 用0.9%氯化钠溶液（NaCl 溶液）稀释至30 mL，与淋巴细胞分离液混合（混合比=1 ∶2.5）离心后制备成功外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。培养液设为GT-551，浓度调至2 × 106/mL，依培养进程，将IFN-γ、IL-1α、IL-2 等细胞因子及CD3 单抗加入后染色，观察细胞形态。

1.2.2IL-15转染CIK 细胞

取出购买含IL-15的病毒上清液。将PBMC 制备的CIK 细胞培养5 d，细胞浓度更换为1×106/mL 后预备转染。 CIK 细胞与含IL-15的慢病毒各1 mL 混合后重新悬浮。在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中连续孵育2 h。之后按25 r/s 离心300 s。后将上清液弃置，用KBM-551 重悬沉淀物。间隔1 d 用上述病毒的上清液，再次进行转染。依据之前的步骤，将上清液按以往转速再次离心300 s。收集上清液置于-80 ℃冰箱备再次实验用。

1.2.3 流式细胞检测

（1）CIK 细胞鉴定：培养3 ～4 d 后，CIK 细胞聚集成团且集落形成；经清洗、染色等步骤后，上机鉴定。

（2）CIK 细胞感染效率鉴定：转基因细胞培养2 d后，在光学显微镜下详细观察CIK 的感染效率。

1.2.4 酶联免疫吸附分析

分别提取IL-15-CIK 细胞及CIK 细胞培养7、11、14 d 的上清液1 mL，用ELISA 法检测IL-15、IFN-γ 和TNF-α 的表达水平。以未转染的CIK 所培育出的上清液作参照。实验前将所有细胞的上清液冰上融化至液态，同时将检测试剂盒平衡至室温，按照ELISA 细胞因子检测试剂盒的说明进行检测操作。

1.2.5 结肠癌细胞培养

将人CRC 细胞株HT-29 培养、传代于DMEM 中（内含10% FBS、100 μg/mL 青/链霉素）。

1.2.6 CCK-8 法检测IL-15-CIK 细胞对结肠癌细胞的杀瘤效果

取培养24 h 的CRC 细胞作为靶细胞，取制备好的CIK 和IL-15-CIK 细胞用作测定实验中的效应细胞。效应细胞分为两组，调整靶细胞浓度为5×103/孔，按效靶比（E∶T）5∶1、10∶1、20∶1、25∶1 混合后经培养箱孵育1 d，每孔各添加15 μL 的CCK-8，酶标仪测量出光密度（optical density，OD），并测算杀伤率。

杀伤率（%）=[1-（研究组OD -效应细胞OD）/靶细胞OD]×100%。

1.2.7 杀瘤前后HT-29 细胞中细胞因子含量测定

选连续培育14 d 效应细胞。收集E∶T 为25∶1时IL-15-CIK 及CIK 细胞对HT-29 细胞株作用前后的上清液各0.5 mL，用ELISA 法检测上清液内IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量变化。以未转染的CIK 所培育出的上清液作参照。实验前将所有细胞的上清液冰上融化至液态，同时将检测试剂盒平衡至室温，按照ELISA 法细胞因子（IL-15、IFN-γ、TNF-α）检测试剂盒的说明进行检测操作。

1.3 统计学方法

数据分析处理均选用SPSS 22.0 版本。计数、计量资料分别以百分率（%）、均数± 标准差表示；组间比较依情况可选用F检验、t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK 及转基因CIK 细胞的鉴定

取连续培养5 d 的CIK 细胞，在光学显微镜下仔细观察可见细胞增殖明显，数目增多，胞体增大，形态渐趋饱满，成团簇状分布，且形成集落（图1）；以鼠抗人IgG 为同型对照，经流式细胞仪鉴定为CIK 细胞（图2）；将培养5 d 的CIK 细胞，用含IL-15的慢病毒感染48 h 后，倒置荧光显微镜镜下观察其明场图和荧光图，说明转基因细胞模型构建成功（图3）。

图1 培养第5 天CIK 细胞（200× ）Fig.1 Image of CIK cells cultured for 5-day(200×)

图2 CIK 细胞鉴定流式图Fig.2 Flow cytometry diagrams of CIK cell identification

图3 IL-15-CIK 细胞的明场图（A）和荧光图（B）（50×）Fig.3 Bright field diagram(A)and fluorescence image(B)of IL-15-CIK cells(50×)

2.2 两种效应细胞对结肠癌细胞的作用比较

CCK-8 法检测结果显示，E ∶T 为10 ∶1 时，IL-15-CIK 细胞与CIK 细胞对CRC 靶细胞具有杀伤能力，但杀伤活性相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。随着E ∶T 增加，杀伤活性逐渐增强，CRC 细胞被IL-15-CIK 细胞及细胞CIK 细胞有效裂解。当E ∶T 达到25 ∶1，IL-15-CIK 细胞与CIK 细胞对CRC 细胞的杀伤作用相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。光学显微镜下对比观察发现，当HT-29 被杀伤前，细胞呈良好贴壁状态（图4A）；IL-15-CIK 细胞杀伤HT-29 细胞后，细胞贴壁状态逐渐转为半贴壁，大量细胞死亡（图4 B）；CIK 细胞杀伤HT-29 细胞时，细胞死亡数量明显少于IL-15-CIK 细胞杀伤后（图4C）。由此说明，IL-15-CIK 细胞对CRC 靶细胞的杀伤能力强于CIK 细胞。

表1 不同E ∶T 下CRC 细胞的杀伤率比较Tab.1 Comparison of killing rate of CRC cells at different E ∶T

图4 HT-29 细胞杀瘤前后效果对比光学显微镜图Fig.4 Image of optical microscopy of HT-29 cells before and after tumor-killing

2.3 两种细胞中细胞因子的分泌及其对HT-29 细胞株杀瘤时影响

2.3.1 不同培养时间两种细胞的细胞因子含量比较

在IL-15-CIK 细胞及CIK 细胞培养7 d、11 d、14 d中，两种细胞上清液中IL-15、IFN-γ 及TNF-α 的含量均随着时间的增长而升高，并且可以观察到转染后细胞的3 种细胞因子含量显著高于未转染细胞，两种细胞间差异明显，两种细胞间不同时间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。但在IL-15-CIK 细胞中观察到，TNF-α含量在11 d 与14 d 内差异无统计学意义（P＞0.05），其余时间相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两种细胞不同培养时间IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量比较Tab.2 Comparison of IL-15，IFN-γ and TNF-α content at different culture time between 2 cell lines

2.3.2 培养14 d 两种细胞杀瘤前后细胞因子含量比较

选体外培养14 d 的IL-15-CIK 细胞及CIK 细胞以E ∶T=25 ∶1 对HT-29 细胞株作用后，检测到两种上清液中IL-15、IFN-γ、TNF-α 的含量较杀瘤前有所变化。在CIK 细胞中，IFN-γ 含量显著变高，较杀瘤前差异有统计学意义（P＜0.05），但IL-15、TNF-α 的含量虽有所增加，但这种变化差异无统计学意义（P＞0.05）。在IL-15-CIK 细胞中，IL-15、IFN-γ、TNF-α含量均较杀瘤前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过对比发现，IL-15-CIK 细胞3 种细胞因子的含量与CIK 细胞相比，明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两种细胞杀瘤前后细胞因子含量比较Tab.3 Comparison of cytokine content before and after tumor-killing between 2 cell line

3 讨论

免疫治疗是目前除传统手术切除、放化疗及靶向药物外，最具发展潜力的肿瘤新兴疗法[7]。而从机体自身或其他机体提取出的免疫细胞，通过扩增、基因工程改造等方式，重新返回机体，以期激发免疫应答反应，进而发挥抗瘤作用的诊疗思路，意即过继性细胞疗法（adoptive cell therapy，ACT）。此种疗法已在临床部分肿瘤中得到广泛应用[8]。近年来发现CIK 细胞在增殖速度、抗瘤效果方面具备一定优势，通过与相关细胞因子共同作用，从而提升其生物学属性[9]。细胞因子参与调控免疫反应，扮演重要角色，对肿瘤的新兴疗法方面有远大前景。 IL 作为一组白细胞重点表达的细胞因子，多数IL 家族因子关于抗瘤治疗上凸显关键[4]。而经基因工程改造的T 淋巴细胞，以IL-2 为节点。近年来，因IL-15 对参与先天免疫和适应性免疫的细胞具有广泛的活性，被认为是免疫基因治疗的强有力的候选者[10]。不仅与IL-2 的功能相似，且可抑制活化诱导的细胞死亡（activation-induced cell death，AICD），减少细胞凋亡并增加T 细胞持久性，且毒性较小[11]。

既往已证实，成功制备14 d 左右的CIK 细胞抗瘤效果达到顶峰。该实验中，笔者选用CIK 细胞和IL-15-CIK 细胞对CRC 细胞进行杀伤活性检测，结果显示当效靶比为10 ∶1，IL-15-CIK 细胞及CIK 细胞对CRC 细胞均具有杀伤能力，表明IL-15-CIK 细胞及CIK 细胞对CRC 均有一定的抑制能力。但随着E ∶T 比值的逐渐升高，转染后细胞对CRC 的杀伤强度显著强于未转染的细胞，同时也证明IL-15-CIK细胞拥有极为明显的针对CRC 细胞株的杀伤特性。

该实验同时表明，TNF-α 等多种细胞因子可被效应细胞自分泌生成。并且当IL-15-CIK 细胞及CIK细胞以E ∶T=25 ∶1 为限对HT-29 细胞进行杀瘤实验后，发现细胞因子IL-15、IFN-γ、TNF-α 较前均有所增加，其中IL-15-CIK 细胞较CIK 细胞的细胞因子含量增加更明显。以上结果表示，当CIK 细胞显著增多后，不仅提升免疫属性，更可分泌具备多种生物效能的细胞因子，且IL-15-CIK 细胞较CIK 细胞在同等时间条件下的杀瘤作用更强。同时细胞因子参与抗瘤后各自发挥其功能。而由CD4+、 CD8+生成的IFN-γ 可对同种生物进行广泛调节。它能使细胞建立抗病毒状态的生物活性，调节细胞生长分化和对免疫系统的调节作用[12]。作为细胞免疫的关键参与者，主要通过抑制肿瘤细胞的分裂、增殖，从而发挥抗瘤作用[13]。多数通过调节引起相关细胞死亡的TNF-α[14]，主要源于巨噬细胞。可直接作用于肿瘤细胞，阻抑肿瘤的形成[15]。