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二甲双胍对H2O2 诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应及增殖、凋亡的作用

2023-11-18杨小军欧阳运萍

生物医学工程与临床 2023年5期
关键词:激活剂肺泡抑制剂

赵 博,杨小军,欧阳运萍,陈 涛,李 鹏

急性肺损伤指各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤, 造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致的急性低氧性呼吸功能不全,死亡率较高[1],且目前临床上未有特效药物用以治疗急性肺损伤,因此亟需寻求有效手段治疗急性肺损伤。在急性肺损伤过程中会产生炎性细胞因子, 体外实验表明一些致病因素如炎性细胞因子等可致肺血管内皮细胞和肺泡1 型细胞凋亡[2,3]。因此,遏制肺部的炎症反应与凋亡相关信号转导可能是改善急性肺损伤的有效治疗手段。二甲双胍为口服类降糖药物,其安全性已得到充分证实。 研究表明二甲双胍可改善脂多糖(lpopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤[4]。 但是二甲双胍对氧化应激所造成急性肺损伤的作用机制研究较少。 有报道指出二甲双胍能够通过p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路减轻氧化应激反应[5]。p38 MAPK 参与了多种呼吸系统疾病的发生发展, 是较为关键的细胞内信号通路, 近年来与慢性阻塞性肺疾病、 急性肺损伤、哮喘等常见呼吸系统疾病关系密切[6]。有研究显示,遏制p38 MAPK 信号通路能够抑制细胞凋亡进而减轻肺损伤[7]。 肺Ⅱ型上皮细胞是氧化损伤的主要靶标,具有较难分离获取且难以在体外传代的特点[8]。人肺泡上皮细胞A549 与Ⅱ型肺泡上皮细胞具有相似的形态及生化特性,故而笔者以人肺泡上皮细胞A549 为研究对象, 探讨二甲双胍是否通过调控p38 MAPK 信号通路表达发挥对肺泡上皮细胞炎症反应、 增殖及凋亡的作用,为氧化应激所致肺损伤的相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

人肺泡上皮细胞A549,购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

1.1.2 药品与试剂

过氧化氢(H2O2)、二甲双胍(纯度≥98%。 上海碧云天生物技术有限公司,中国);p38 MAPK 通路抑制剂SB 203580,p38 MAPK 通路激活剂C16-PAF(纯度≥99%。 上海源叶生物科技有限公司,中国);F-12K 培养液(北京索莱宝生物科技有限公司,中国);胎牛血清(上海优宁维生物科技有限公司,中国);放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、细胞计数试剂盒-8(cell count Kit-8,CCK-8)、5-乙炔基-2" 脱氧尿嘧啶核苷 (5-acetylidene-2"deoxyuracil nucleoside,EdU)细胞增殖检测试剂盒、鼠抗人[p38 MAPK、p-p38 MAPK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic protease,Caspase)-3、细胞周期素D1(Cyclin D1)及β-肌动蛋白(beta-actin,β-actin)一抗]、辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗鼠IgG)(上海翌圣生物科技股份有限公司,中国);酶联免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒 (上海恒远生物科技有限公司);Hoechst 33258 染色试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司,中国)。

1.1.3 主要仪器

层流超净工作台(型号VS-840-1。上海博迅实业有限公司, 中国); 倒置荧光显微镜 (型号WMJ-9930BD。 上海豫光仪器有限公司,中国);超纯水仪(型号OSJ-UP。 博科医疗器械有限公司);酶标仪(型号Multiskan FC。 美国Thermo 公司);智能高速冷冻离心机(型号TG18G。 盐城凯特实验仪器有限公司,中国)。

1.2 方法

1.2.1 人肺泡上皮细胞A549 培养

于超低温冰箱中取肺泡上皮细胞A549 冻存细胞进行复苏后,加F-12K 培养液(含1%青-链霉素、10 %胎牛血清、5 % CO237 ℃) 培养, 待细胞贴壁(80 %~90%)后传代,取第3 代(对数生长期细胞)进行实验。

1.2.2 分组及给药

将细胞分为对照组、H2O2组、1.25 mmol/L 二甲双胍组、2.50 mmol/L 二甲双胍组、5.00 mmol/L 二甲双胍组、SB 203580 组、抑制剂组和激活剂组。 对照组细胞不做干预,H2O2组以400 μmol/L H2O2刺激A549 细胞24 h 构建体外急性肺损伤细胞模型,1.25 mmol/L 二甲双胍组、2.50 mmol/L 二甲双胍组、5.00 mmol/L 二甲双胍组在H2O2组基础上分别加入1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲双胍进行干预,SB 203580 组在H2O2组基础上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制剂SB 203580 进行干预, 抑制剂组在5.00 mmol/L 二甲双胍组基础上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制剂SB 203580 进行干预, 激活剂组在5.00 mmol/L 二甲双胍组基础上加入10 μmol/L p38 MAPK 通路激活剂C16-PAF 进行干预,干预24 h(复孔×3)。 后置培养箱(37 ℃、体积分数5%CO2)培养。

1.2.3 CCK-8 法

采用CCK-8 测定人肺泡上皮细胞A549 活力。

取8 组细胞(96 孔板,2×105)加细胞悬液100 μL干预24 h。加CCK-8 溶液(10 μL)培养2 h,酶标仪测各孔光密度(optical density,OD)(450 nm 处)值后计算细胞活力。 细胞活力=OD(1.25 mmol/L 二甲双胍组或2.50 mmol/L 二甲双胍组或5.00 mmol/L 二甲双胍组或H2O2组或SB 203580 组- 空白组)/OD (对照组-空白组)。

1.2.4 酶联免疫吸附分析法

采用ELISA 检测人肺泡上皮细胞A549 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醇(malondialdehyde,MDA)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达水平。

8 组细胞收集后于4 ℃、12 000 g 条件下离心(10 min) 取上清液, 按照ELISA 试剂盒说明书测定SOD、MDA 和IL-6 水平。测量各孔在450 nm 处的OD值后根据标准曲线计算相关因子表达水平。

1.2.5 EdU 法

测定人肺泡上皮细胞A549 增殖率。取8 组细胞,去除培养液后固定(4%多聚甲醛,0.5 mL)15 min,用牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)(3 %,0.5 mL)洗涤3 次,洗去多余的多聚甲醛和细胞,然后用TritonX-100 (0.3 %,0.5 mL,10 min) 去除残留BSA,再用BSA(3%,0.5 mL)洗涤3 次;每孔加200 μL Click 反应液(12 孔板)后室温下避光孵育(30 min),用BSA(3 %,0.5 mL)洗涤3 次;加入Hoechst 处理10 min 洗涤3 次后装片,拍照(荧光显微镜)、数据处理(ImageJ 软件)。 用ImageJ 分别计算红色细胞和蓝色细胞数量,最后计算细胞增殖率,计算方法为:红色细胞数占蓝色细胞数(即总细胞)的比值。

1.2.6 Hoechst 33258 染色法

测定人肺泡上皮细胞A549 凋亡率。

将干预24h 的细胞用PBS 洗涤细胞2 次(5 分/次),加入新鲜配置4%多聚甲醛,于4 ℃固定10 min。洗涤3 次,用Hoechst 33258 染色液(5 mg/L)染色10 min,洗涤3 次,封固后荧光显微镜观察,对细胞凋亡情况进行拍照。

细胞凋亡特征:核体积浓缩变小,染色不均浓染且所发荧光较强,呈亮蓝色。

细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总的细胞数)×100%。

1.2.7 Western blot 法

检测人肺泡上皮细胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 与p38 MAPK 信号通路相关蛋白的表达水平。

取各组4 h 的细胞,提取各组细胞蛋白质定量后上样,跑胶,转膜,封闭2 h 后参照抗体说明书加入一定稀释比例的一抗 (p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、Cyclin D1 及β-actin),孵育过夜(4 ℃)后,用洗涤缓冲溶液洗涤,加二抗(山羊抗鼠IgG,孵育2 h),洗涤(3 次),显影后拍照(凝胶成像系统)记录。蛋白表达量为目的蛋白的蛋白灰度值(G)占内参蛋白(β-actin)的比值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。 计量资料表示方法为均数± 标准差表示, 多组间表示方法为单因素方差分析,符合正态分布且方差齐时,两组间比较Dunnett’t检验;不符合正态分布时,采用秩和检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度二甲双胍组、 对照组、H2O2 组、SB 203580 组人肺泡上皮细胞A549 活力比较

干预24 h 后,与对照组相比,H2O2组细胞活力显著降低(P<0.05);与H2O2组比较,1.25、2.50 mmol/L二甲双胍组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组细胞活力显著升高(P<0.05),因此选择在5.00 mmol/L 二甲双胍基础上分别加入p38 MAPK 通路抑制剂和激活剂作为抑制剂组和激活剂组进行p38 MAPK 通路验证。见图1。

图1 6 组A549 细胞的细胞活力比较Fig. 1 Comparison of cell viability histograms of A549 cells in 6 groups

2.2 6 组人肺泡上皮细胞A549 SOD、MDA 和IL-6表达水平比较

干预24 h 后,与对照组比较,H2O2组细胞MDA、IL-6 表达水平显著升高(P<0.05),SOD 表达水平显著降低(P<0.05);与H2O2组比较,5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组MDA、IL-6 表达水平显著降低(P<0.05),SOD 表达水平显著升高(P<0.05);与5.00 mmol/L 二甲双胍组比较, 抑制剂组MDA、IL-6表达水平进一步下降(P<0.05),SOD 表达水平进一步上升(P<0.05),激活剂组MDA、IL-6 表达水平上升(P<0.05),SOD 表达水平下降(P<0.05)。 见表1。

表1 6 组A549 细胞MDA、SOD、IL-6 表达水平比较Tab.1 Comparison of expression levels of A549 cells MDA,SOD and IL-6 in 6 groups

2.3 6 组人肺泡上皮细胞A549 的增殖率比较

干预24 h 后,与对照组比较,H2O2组细胞增殖率显著降低 (0.27±0.03vs0.56± 0.03。t= 0.360,P<0.05);与H2O2组比较,5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组细胞增殖率显著升高(0.42±0.03vs0.27±0.03,0.43 ± 0.03vs0.27 ± 0.03。t= 0.241、0.257,P<0.05);与5.00 mmol/L 二甲双胍组比较,抑制剂组细胞增殖率进一步上升(0.54±0.03vs0.42±0.03。t=0.192,P<0.05), 激活剂组细胞增殖率下降 (0.28±0.04vs0.42±0.03。t=1.225,P<0.05)。 见图2。

图2 6 组A549 细胞增殖率比较EdU 增殖图(×20,比例尺长度为100 μm)Fig.2 EdU proliferation images of A549 cells proliferation rate in 6 groups(×20,scale bar:100 μm)

2.4 6 组人肺泡上皮细胞A549 凋亡情况比较

干预24 h 后,与对照组比较,H2O2组细胞凋亡率显著升高(68.67%±3.06%vs7.67%±1.53%。t=46.938,P<0.05);与H2O2组比较,5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组细胞凋亡率显著降低(38.00%±3.6 %1vs68.67 % ± 3.06 %,39.00 % ± 3.61 %vs68.67 % ± 3.06 %。t= 18.082、17.493,P<0.05);与5.00 mmol/L 二甲双胍组比较, 抑制剂组细胞凋亡率进一步下降(9.00%±1.73%vs38.00%±3.61%。t=19.691,P<0.05),激活剂组凋亡率上升(57.67%±4.51%vs38.00%±3.61%。t=9.719,P<0.05)。 见图3。

图3 6 组A549 细胞的凋亡Hoechst 33258 染色图(×20,比例尺长度为100 μm)Fig.3 Hoechst 33258 staining images of A549 apoptosis in 6 groups(×20,scale bar:100 μm)

2.5 6 组人肺泡上皮细胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表达水平比较

干预24 h 后,H2O2组细胞Caspase-3 表达水平较对照组升高(0.50±0.01vs0.05±0.01。t=0.722,P<0.05),Cyclin D1 水平较对照组降低 (0.30 ± 0.04vs0.80±0.03。t=0.802,P<0.05);5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组Caspase-3 水平较H2O2组降低(0.11±0.02vs0.50±0.01,0.13±0.04vs0.50±0.01。t= 0.626、0.594,P<0.05),Cyclin D1 水平较H2O2组上升(0.50±0.05vs0.30±0.04,0.50±0.02vs0.30±0.04。t=0.321、0.321,P<0.05); 在抑制剂组细胞中Caspase-3 水平较5.00 mmol/L 二甲双胍组进一步下降 (0.05 ± 0.01vs0.11 ± 0.02。t= 0.096,P<0.05),Cyclin D1 水平较5.00 mmol/L 二甲双胍组进一步上升(0.80±0.02vs0.50±0.05。t=0.481,P<0.05),激活剂组Caspase-3 水平上升 (0.50 ± 0.03vs0.11 ±0.02。t=0.626,P<0.05),Cyclin D1 水平下降(0.30±0.03vs0.50±0.05。t=0.321,P<0.05)。 见图4。

图4 6 组A549 细胞中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoretogram of A549 cells Caspase-3 and Cyclin D1 protein expression in 6 groups

2.6 6 组人肺泡上皮细胞A549 中p38 MAPK 信号通路相关蛋白的表达水平比较

对p38 MAPK 信号通路关键蛋白p38 MAPK 和p-p38 MAPK 表达水平进行检测后发现,与对照组比较,H2O2组细胞p-p38 MAPK 蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与H2O2组比较,5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组p-p38 MAPK 蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与5.00 mmol/L 二甲双胍组比较,pp38 MAPK 蛋白表达水平在抑制剂组中进一步显著降低(P<0.05),而在激活剂组中p-p38 MAPK 表达水平上升(P<0.05),p38 MAPK 表达水平在各组中均无显著性变化(P>0.05)。 图5、表2。

表2 6 组A549 细胞中p38 MAPK 信号通路相关蛋白表达水平比较Tab.2 Comparison of A549 cells expression levels of p38 MAPK signaling pathway-related proteins in 6 groups

图5 6 组A549 细胞中p38 MAPK 信号通路相关蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoretogram of A549 cells p38 MAPK signaling pathway-related protein expression in 6 groups

3 讨论

急性肺损伤作为临床常见的危重急症,发病时通常出现肺泡通透性增加、急性低氧性呼吸衰竭和肺泡水肿等症状[9]。 由于急性肺损伤发病机制较为复杂且尚不完全明确,目前临床上仍有较高的病死率[10]。 机械通气疗法对症治疗急性肺损伤是唯一提高其生存率的方法,临床多为酮康唑、抗氧化剂、营养素、糖皮质激素等对症治疗方法,还未有明确有效药物作为治疗方法[11,12]。因此,探究有效药物治疗急性肺损伤具有重要意义。

二甲双胍是临床上已经应用多年的双胍类口服降糖药,除具有降糖作用外,近年来研究发现其还能发挥抗炎效应及减少氧化应激损伤[13,14]。 吴柯佳[15]研究显示二甲双胍能够通过腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activated protein kinase,AMPK) 抑制雷帕霉素靶蛋白复合体1(rapamycin target protein complex 1,mTORC1)减轻内毒素诱导的急性肺损伤,从而发挥抗炎作用。另有研究表明二甲双胍能够通过激活信号通路起到对H2O2诱导的PC12 细胞损伤的保护作用[16]。 Wang Y 等[17]在LPS 诱导的急性肺损伤中的研究显示, 二甲双胍具有减轻肺组织的损伤的作用,但二甲双胍作用H2O2诱导的急性肺损伤鲜有报道。 笔者研究发现,H2O2组处理A549 细胞后其活力明显降低, 而5.00 mmol/L 二甲双胍组和SB 203580 组细胞活力明显高于H2O2组, 提示H2O2能够降低细胞活力,5.00 mmol/L 二甲双胍和SB 203580 则能够促进细胞活力。 因只有5.00 mmol/L 二甲双胍组与H2O2组相比细胞活力差异有统计学意义,故而笔者研究选择该浓度进行后续实验。结果表明经H2O2诱导后A549细胞凋亡率、MDA、IL-6 表达、Caspase-3 表达水平上升,增殖率、SOD 和Cyclin D1 水平下降,说明H2O2能够抑制细胞增殖、 诱导凋亡并减轻H2O2诱导的氧化损伤。 加入5.00 mmol/L 二甲双胍和SB 203580 处理后,则显著扭转了这些指标的变化趋势,证明二甲双胍和SB 203580 可以抑制H2O2诱导的A549 细胞的凋亡、氧化损伤与炎症反应并改善细胞增殖,这与熊存全等[18]研究结果姜黄素能够抑制A549 细胞凋亡并对H2O2诱导的A549 细胞急性损伤具有保护作用的报道相符。 以上结果说明了二甲双胍在H2O2诱导的A549 细胞急性损伤中通过上调Cyclin D1 水平促进细胞增殖,下调Caspase-3 水平抑制细胞凋亡、氧化损伤及炎症反应,进而起到保护肺组织损伤的作用。

p38 MAPK 是MAPK 家族中的重要成员之一,近年来研究表明p38 MAPK 信号通路有调控急性肺损伤炎症反应、调节细胞凋亡及内皮通透性的作用[19,20]。Zhao Y 等[21]研究发现p38 MAPK 活化后能够上调炎症反应及凋亡蛋白Caspase-3/7 表达, 促进肺内皮细胞的凋亡。 Grimsey NJ 等[22]发现p38α 自磷酸化可以调控IL-6 表达,影响内皮细胞通透性。另有研究表明阻断p38 MAPK 信号通路能够减轻肺损伤[23]。 上述研究表明,p38 MAPK 信号通路与急性肺损伤及炎症反应关系密切。王贵佐等[24]研究显示二甲双胍具有保护LPS 诱导的急性肺损伤的作用。 武丽涛等[25]在二甲双胍对急性肝损伤的研究中发现,经处理后,IL-6 表达水平降低,可能是通过抑制p38 MAPK 信号通路减轻炎症反应。 另有在LPS 所致急性肺损伤研究中显示黄芩苷能够通过抑制p38 MAPK 信号通路起到有效保护作用[26]。 因此,笔者为探究二甲双胍对H2O2诱导的急性肺损伤与p38 MAPK 信号通路的调控作用,开展了相关实验, 结果显示,H2O2诱导后p-p38 MAPK蛋白表达显著高于对照组, 在加入5.00 mmol/L 二甲双胍和SB 203580 后p-p38 MAPK 蛋白表达显著低于H2O2组,这提示可能是因为二甲双胍和SB 203580抑制了p38 MAPK 通路的信号转导。 在5.00 mmol/L二甲双胍组基础上分别加入p38 MAPK 信号通路抑制剂SB 203580 和激活剂C16-PAF 进行p38 MAPK通路进行验证, 发现加入抑制剂后, 细胞凋亡率、MDA、IL-6 表达、Caspase-3、p-p38 MAPK 蛋白表达进一步降低, 增殖率、SOD 和Cyclin D1 蛋白表达水则进一步升高,而激活剂组则扭转了这一趋势。 提示二甲双胍促进H2O2诱导的A549 细胞的增殖,抑制凋亡、 氧化损伤及炎症反应, 可能是通过抑制p38 MAPK 信号通路发挥作用的。

综上所述,笔者实验证明二甲双胍能够显著缓解H2O2诱导的人肺泡上皮细胞A549 炎症反应,减轻氧化损伤,并通过上调Cyclin D1 促进增殖,下调Caspase-3 抑制细胞凋亡, 其作用机制可能与抑制p38 MAPK 通路的信号转导相关。接下来可探究二甲双胍是否通过其他信号通路发挥对H2O2诱导的急性肺损伤保护作用,为阻断急性肺损伤的相关研究提供新的切入点。

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