保健食品中B族维生素的快速分析方法研究

周新星 张玲玲 周晓莹 施莎敏 任亦洋 贾福怀

摘 要：目的：建立同时分析烟酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B2且前处理简单的快速检测方法。方法：样品用0.1%三氟乙酸溶液超声提取，C18色谱柱分离，以0.1%三氟乙酸-乙腈为流动相梯度洗脱，紫外检测器检测。结果：方法对4种B族维生素的分离效果明显，分离度全部超过1.5，标准曲线呈直线回归，相关系数大于0.999 5，检测结果与国家标准方法一致。结论：该方法操作更便捷，分析速度快，灵敏度和准确度高，适用于保健食品中4种B族维生素含量的检测。

关键词：B族维生素；高效液相色谱法；保健食品；同时分析

Study on Rapid Analysis Method of B-Group Vitamins in Health Food

ZHOU Xinxing1， ZHANG Lingling1*， ZHOU Xiaoying2， SHI Shamin1， REN Yiyang1， JIA Fuhuai1

（1.Ningbo Yufangtang Biotechnology Co.， Ltd.， Ningbo 315012， China; 2.Ningbo Yuyi Biotechnology Co.， Ltd.， Ningbo 315012， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid method for the simultaneous analysis of niacinamide， vitamin B1， vitamin B6 and vitamin B2 with simple pretreatment. Method： The samples were extracted with 0.1% trifluoroacetic acid solution by ultrasonication， separated on a C18 column， eluted with 0.1% trifluoroacetic acid-acetonitrile as the mobile phase gradient， and detected by ultraviolet detector. Result： The method was effective for the separation of the four B vitamins， and the separation degree was more than 1.5 for all of them. The standard curve showed linear regression， and the correlation coefficient was more than 0.999 5， and the detection results were in agreement with the national standard method. Conclusion： The method is more convenient to operate， fast to analyze， with high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of the contents of the 4 B vitamins in health food.

Keywords： B vitamins; high performance liquid chromatography; health food; simultaneous analysis

近些年，人們越来越意识到B族维生素是人体不可缺少的重要营养素，市场上也出现越来越多的多种维生素片、复合维生素片以及维生素类功能饮料等保健食品。目前国家标准中测定B族维生素含量的方法大多数前处理复杂、耗时长且成本高[1-4]。因此，研究出能同时快速准确分析保健食品中烟酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B2且前处理简单的检测方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集市场上畅销的3种含多种B族维生素的保健食品，作为实验1号、2号、3号样品。

烟酰胺（批号为100115-202005，纯度为99.9%）、维生素B1（批号为100390-202107，纯度为97.4%）、维生素B6（批号为100116-201906，纯度为99.9%）和维生素B2（批号为100369-201905，纯度为98.2%），均由中国食品药品检定研究院出品；乙腈（HPLC）、盐酸（GR），国药集团；三氟乙酸（HPLC），阿拉丁；超纯水，由Arium Comfort I纯水超纯水一体机制得，其电阻率不大于18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪（DAD检测器），美国安捷伦公司；METTLER TOLEDO XS205DU 电子天平，梅特勒-托利多集团；KH-250DB数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；Arium Comfort I纯水超纯水一体机，赛多利斯（上海）贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

精密称取维生素B2标准品10 mg于适宜容量瓶中，加入盐酸溶液（1+1）2 mL并超声溶解，然后用水定容摇匀，配成100 μg·mL-1的维生素B2标准储备液；分别精密称取20 mg烟酰胺、维生素B1及维生素B6标准品于适宜容量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容摇匀，配成浓度为400 μg·mL-1的标准储备液。精密移取每种标准储备液适量，用0.1%三氟乙酸稀释定容，从而得到烟酰胺浓度100 μg·mL-1、维生素B1浓度50 μg·mL-1、维生素B6浓度50 μg·mL-1、维生素B2浓度50 μg·mL-1的混合标准溶液并逐级稀释成标准曲线。

1.3.2 样品处理

精密量取混合均匀的液体样品1 mL或精密称取研磨混匀的固体样品0.1 g于适宜的容量瓶中，加适量的0.1%三氟乙酸溶液，超声提取5 min，待样液冷却后定容摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相：A为0.1%三氟乙酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱见表1。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

根据维生素B1、维生素B6、烟酰胺、维生素B2的理化性质[5]，对不同提取方法和提取溶剂进行研究，选择出最佳提取条件。

2.1.1 提取方法

以1号样品为试样，考察了在室温下用0.1%三氟乙酸溶液超声提取5 min、手摇振荡提取5 min和摇匀静置提取5 min 3种不同提取方法对4种B族维生素提取效果的影响。结果显示，对于维生素B2，超声提取的提取率明显高于其他两种方法；对于其他3种B族维生素，3种提取方法的提取率比较接近。综合考虑，后续实验均采用超声提取。

2.1.2 提取溶剂

以1号样品为试样，考察了纯水、盐酸、0.1%三氟乙酸溶液的提取效果。实验结果显示，纯水对维生素B6的提取效果明显比其他两种溶剂差；盐酸对烟酰胺的提取效果明显比其他两种溶剂差；对于其他两种B族维生素，0.1%三氟乙酸溶液的提取效果与其他两种溶剂相近。因此，在接下来的实验中都选用0.1%三氟乙酸溶液作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

本次实验选择三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，提高分离效果，避免离子对试剂损害色谱柱的同时也大大降低了检测成本。

2.2.2 色谱柱的选择

通过实验对比了两款性能较优的C8柱与C18柱的分离效果，发现经过梯度洗脱程序优化后C8柱未能将维生素B1和维生素B6分离开，而且维生素B2出峰位置处有梯度引起的基线波动，会对结果造成影响，而C18柱的分离效果良好，因此后续实验均采用C18柱。同时本实验也比较了25 ℃、35 ℃及40 ℃柱温下4种维生素色谱峰的分离效果，结果表明柱温改变对分离效果几乎无影响，因此后续实验均采用25 ℃柱温。

2.2.3 检测波长的选择

各种维生素最大紫外吸收波长都不相同，故本实验对4种维生素在波长200～450 nm进行紫外图谱扫描。在兼顾每种B族维生素最大紫外吸收波长和灵敏度的基础上，实验采用紫外280 nm检测，4种B族维生素的分离效果良好。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性实验

取适量1.3.1项下的混合标准溶液和1.3.2项下的试样溶液，根据1.3.3项下的色谱条件进行实验。样品色谱图中B族维生素的理论塔板数均大于5 000，分离度均大于1.5，均达到基线分离，因此本方法能进行定性定量分析。

2.3.2 线性关系及检出限实验

取1.3.1项下的混合标准溶液，用0.1%三氟乙酸水溶液稀释制备成系列混合标准溶液，根据1.3.3项下的色谱条件进行实验，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，得到4种维生素的回归方程。烟酰胺为y=3.273 4x+0.555 8，r=0.999 8；维生素B1为y=16.145x-4.039 7，r=0.999 8；维生素B6为y=33.789x+0.32，r=0.999 9；维生素B2为y=58.074x-5.227，r=1.000 0。用3倍信噪比（S/N=3）确定检出限，烟酰胺的检出限为0.3 μg·mL-1，其他维生素均为0.2 μg·mL-1。实验结果显示，烟酰胺在5～50 μg·mL-1呈直线回归，其他维生素在2.5～25 μg·mL-1呈直线回归，相关系数均大于0.999 5，检出限低，所以本方法能进行定量分析。

2.3.3 精密度实验

（1）重复性。准确称取6份实验1号样品，根据1.3.2项的方法进行供试液的配制，并根据1.3.3项的色谱条件进行检测，测得各B族维生素的相对标准偏差在0.41%～1.79%，表明该方法精密度高。

（2）重现性。不同实验员（n=3）用本方法对实验1号、2号、3号样品进行独立测定，其相对标准偏差在0.11%～1.96%，表明该方法重现性良好。

2.3.4 加标回收实验

准确称取6份实验1号样品，每2份为1组，共3组，再分别加入低（样品浓度80%）、中（样品浓度100%）、高（样品浓度120%）的标准溶液，根据1.3.2项的方法进行供试液的配制，并根据1.3.3项的色谱条件进行检测，计算得到回收率（表2）。测得各B族维生素平均回收率在98.1%～99.6%，相对标准偏差在1.29%～2.06%，由此可见该方法回收率好。

2.4 实际样品的检测

用本方法和国家标准方法对实验1号、2号、3号样品进行测定，并比较检测结果（表3）。本方法和国标方法测定结果偏差较小，均在允許范围内，因此本方法可用于保健食品中B族维生素的检测。

3 结论

本文建立了同时测定保健食品中B族维生素的方法，经过色谱条件的优化，成功实现了烟酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B2的基线分离。本方法操作流程简便，前期处理工作量少，实用性较高，能在25 min内完成上述4种维生素的同时检测，能为保健食品中B族维生素的同时分析提供实际帮助。

参考文献

[1]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定：GB 5009.89—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[2]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定：GB 5009.84—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定：GB 5009.154—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定：GB 5009.85—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]吴景，邢书霞，曹进.食品中维生素检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015（8）：2881-2889.