高效液相色谱法同时测定小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚

姜志远 马可佳 王缘 王晓婧 赵岚

摘 要：目的：建立同时测定小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚含量的方法，以此提高非食品原料的检测效率。方法：采用乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）提取样品中的乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚这3种化合物，40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液复溶后过滤检测。以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，通过高效液相色谱仪进行测定。结果：乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚在0.50～10.00 μg·mL-1，线性关系良好（r≥0.999），检出限分别为0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1。以空白样品为基体，在1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1这3个浓度下进行加标回收实验，平均回收率均为97.2%～99.7%，相对标准偏差≤1.79%（n=6）。结论：该方法成功用于市售48种小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的含量测定，可为小麦粉中非食品原料的日常检测提供参考。

关键词：小麦粉；乙二胺四乙酸二钠；曲酸；间苯二酚；高效液相色谱法

Simultaneous Determination of Disodium Ethylenediaminetetraacetic Acid， Kojic Acid， and Resorcinol in Wheat Flour by HPLC

JIANG Zhiyuan， MA Kejia， WANG Yuan， WANG Xiaojing， ZHAO Lan

（Heilongjiang Provincial Center for Disease Control and Prevention， Harbin 150030， China）

Abstract： Objective： To establish a method for simultaneous determination of disodium EDTA， kojic acid and resorcinol in wheat flour， so as to improve the detection efficiency of non-food raw materials. Method： Acetonitrile-methanol-aqueous solution （5∶4∶1） was used to extract disodium ethylenediamine tetraacetate， kojic acid and resorcinol from the samples. Nitrogen was blown to near-dry in a water bath at 40 ℃， and then filtered by 50% acetonitrile solution. Using acetonitrile-0.1% formic acid solution as mobile phase， the method was determined by high performance liquid chromatography. Result： The linear relationship between disodium-EDTA， kojic acid and resorcinol was good （r≥0.999） in 0.50～10.00 μg·mL-1， and the detection limits were 0.006 μg·kg-1， 0.005 μg·kg-1 and 0.003 μg·kg-1， respectively. Using blank samples as matrix， the standard recovery experiments were carried out at the concentrations of 1.0 mg·kg-1， 2.0 mg·kg-1 and 4.0 mg·kg-1. The average recoveries were 97.2%～99.7%， and the relative standard deviations were less than 1.79%（n=6）. Conclusion： The method was successfully used for the determination of disodium EDTA， kojic acid and resorcinol in 48 kinds of wheat flour， which can provide reference for the daily detection of non-food raw materials in wheat flour.

Keywords： wheat flour; disodium ethylenediamine tetraacetic acid; kojic acid; resorcinol; high performance liquid chromatography

小麥粉中含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪及膳食纤维等营养成分，是北方居民餐桌上重要的主食来源，因此市售小麦粉的品质受到食品监管部门的高度重视。但有些不法商贩通过向劣质小麦粉中添加防腐剂、抗生素和增白剂等非食品原料，掩盖小麦粉质量低劣的事实，使市售小麦粉的感官性状达到出厂标准，这种行为存在很大的食品安全风险，严重危害了广大消费者的身体健康。在这些添加剂中，乙二胺四乙酸二钠属于超范围使用的食品添加剂[1-2]，曲酸、间苯二酚是国家食药总局明令禁止使用的化学成分[3-4]。市售小麦粉中是否添加乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚等非法添加剂，是评价小麦粉安全性的主要依据，因此研究市售小麦粉中多种非食品原料检测方法非常重要。

本实验采用高效液相色谱法同时对市售小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚这3种化合物进行检测分析，探索同时测定小麦粉中多种非法添加劑的方法，为小麦粉的安全性评价及质量监督提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦粉样品48批次，购自哈尔滨市、齐齐哈尔市、绥化市等地的粮油市场。

乙二胺四乙酸二钠（含量：99.0%；批号：20200701），国药集团化学试剂有限公司；曲酸（含量：100.0%；批号：CCFD200382），德国卡特化工有限公司；间苯二酚（含量：99.9%；批号：21071189），坛墨质检-标准物质中心；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），美国Merck公司；甲酸（色谱纯），DIKMA公司。

1.2 仪器与设备

2695型高效液相色谱仪；Watere 2489型检测器；GP324S电子天平，Sartorius公司；DC24H氮吹仪，安谱科学仪器公司；KQ500VDE型超声波清洗器，昆山市超声仪器；3K15型高速冷冻离心机，SIGMA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取乙二胺四乙酸二钠、曲酸标准物质适量，分别用30%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的标准储备液；称取间苯二酚标准物质适量，用80%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的标准储备液。移取上述标准溶液适量，用50%乙腈溶液稀释成浓度为0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理

称取市售小麦粉样品5.0 g，置于聚丙烯离心管中，加入乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）10 mL，振摇混匀后，涡旋混匀10 min，超声处理15 min，8 000 r·min-1离心10 min，获取上清液并置于另一离心管中；再次加入乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）10 mL，重复提取一次，合并两次小麦粉提取液。移取10 mL提取液，置于带刻度的离心管中，在40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液复溶以后，定容至2 mL，过0.22 μm滤膜后进样检测[5-9]。

1.3.3 色谱条件

DiamonsiL-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样体积：20 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液；检测波长：275 nm；梯度洗脱程序见表1。

1.3.4 样品测定

小麦粉样品经过前处理后，注入液相色谱分析并计算乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立3种化合物的标准曲线，将样品峰面积代入到标准曲线中，计算小麦粉样品溶液中的化合物含量。

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

参考文献[10-12]中的色谱条件，改变流动相中乙腈、0.1%甲酸溶液的比例，研究了不同梯度下乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的理论塔板数和分离度，结合3种化合物的保留时间，确定了最佳流动相比例。在这种流动相条件下，3种化合物的理论塔板数均不小于5 000，各个色谱峰的分离度均不小于1.5，具体结果见图1、图2、图3。

2.2 检测波长的选择

乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的紫外吸收峰值不同。间苯二酚和曲酸的最大吸收波长在260～280 nm，乙二胺四乙酸二钠的最大吸收波长在250～280 nm，为兼顾各个成分的灵敏度，并能实现同时测定的目的，选择275 nm作为3种化合物共有的检测波长。

2.3 提取溶剂的选择

根据3种化合物的溶解性和相关文献资料的报道，选择常用试剂甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、50%乙腈、乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）作为提取溶剂进行比较。结果表明，选择甲醇、乙醇提取小麦粉样品，乙二胺四乙酸二钠的回收率低于70%；选择50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈提取小麦粉样品，进样后获得的色谱图中干扰峰较多，专属性不强；选择乙腈-甲醇-水溶液（5∶4∶1）提取小麦粉样品，离心后上清液清澈透明，色谱图中没有干扰峰，3种化合物均能获得良好的回收率，可以满足定量检测要求。

2.4 线性范围分析

准确移取3种化合物的标准系列浓度溶液各20 mL，按照由低到高的浓度依次进样检测，将峰面积（Y）作为纵坐标，将浓度（X）作为横坐标，绘制标准曲线，结果表明，乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3种化合物在0.50～10.00 μg·mL-1时，线性关系良好（表2）。

2.5 最低检出限

在“1.3.3”的色谱条件下，将标准混合使用液用50%乙腈溶液逐级稀释进样，以3倍信噪比估算乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚的最低检出限。由表2可知，乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚这3种化合物的检出限分别为0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1，方法的检出限满足质量分析的要求。

2.6 加标回收率实验

为了确定检测方法的回收率，选择清洗后干燥麦粒经粉碎获得的小麦粉作为加标回收率实验的空白基质。分别移取“1.3.1”项下的标准储备液，依次加入5.0 g空白基质中，按“1.3.2”方法制备浓度为1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1的加标样品溶液，每个浓度水平设置6个平行样。如表3所示，小麦粉中乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3种化合物的平均回收率在97.2%～99.7%，平均相对标准偏差在1.06%～1.79%，说明回收率良好。

2.7 市售样品测定

采用本方法对市售48种小麦粉中的乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3种化合物进行测定，结果未检出这3种化合物，说明检测的小麦粉中不存在乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3种非食品原料的问题。本方法可用于小麦粉样品的快速定量检测。

3 结论

本文建立的高效液相色谱方法可以实现乙二胺四乙酸二钠、曲酸和间苯二酚3种化合物的有效分离，灵敏度高，线性关系良好，回收率高，且成功应用于市售48种小麦粉中3种化合物的分离测定。

参考文献

[1]李硕，李莉，曹进，等.高效液相色谱法检测面粉中的乙二胺四乙酸二钠[J].食品安全质量检测学报，2017，8（2）：639-645.

[2]巫立健，赖国银，白松，等.高效液相色谱法测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的含量[J].分析测试学报，2017，36（10）：1230-1234.

[3]食品药品监督管理总局.关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告（2017年第132号）[EB/OL].（2017-11-02）[2023-07-17].http：//www.cnhfa.org.cn/news/show.php？itemid=1872.

[4]国家食药监总局.严查在小麦粉中添加非食品原料行为[J].粮食加工，2019，44（1）：66.

[5]简龙海，钟吉强，王欣美，等.高效液相色谱法同时测定面粉及面粉改良剂中的丙烯酰胺和噻二唑[J].中国食品卫生杂志，2014，26（4）：354-357.

[6]林芳.超高效液相色谱串联质谱法同时测定面粉中曲酸和噻二唑[J].现代食品，2020（14）：198-201.

[7]顾慧莹，张颖，赵丽莉．高效液相色谱法测定面粉中的曲酸[J].农业机械，2013，3（9）：65-66．

[8]田芳洁，康明芹，曹海微，等.高效液相色谱法测定腌渍食用菌中的乙二胺四乙酸二钠[J].粮食与油脂，2017，30（4）：90-93.

[9]韩秋珍，周芳梅，张思妹.高效液相色谱法测定蜜饯中乙二胺四乙酸二钠的含量[J].现代食品，2016（12）：91-96.

[10]申科敏，胡晓琴，郭崇政.高效液相色谱法对小麦粉中4种禁用成分的测定[J].长治医学院学报，2019，33（2）：98-101.

[11]王妍，李志剛，赵文涛，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定小麦粉中硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四环素[J].食品科学，2021，42（22）：324?330.

[12]杨帅，穆蕾，杨悠悠，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定小麦粉中28种真菌毒素[J].中国粮油学报，2020，35（6）：159-164.