HPLC法测定粿条中的脱氢乙酸

郭张虹 张杨 陈银海

摘 要：目的：建立一种测定粿条中脱氢乙酸的高效液相色谱方法。方法：在样品中加入水、硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值，摇匀，超声提取后加水定容并高速离心，取适量上清液过滤，用高效液相色谱仪测定，检测波长293 nm。结果：在流动相设定为0.02 mol·L-1乙酸铵（pH值调节至8.0）∶甲醇=90∶10的条件下，脱氢乙酸的峰形对称、无拖尾现象；脱氢乙酸响应强度与浓度（1～200 μg·mL-1）之间呈现良好的线性关系，线性相关性系数R2=0.999 98。测定的加标回收率为84.3%～106.0%，相对标准偏差为2.37%～2.90%。结论：该方法处理过程简便、准确度高，具有良好的重现性，能够准确测定粿条中脱氢乙酸的含量，易在基层检测机构推广，具有实际应用价值。

关键词：高效液相色谱；粿条；脱氢乙酸

Determination of Dehydroacetic Acid in Rice Noodles by HPLC

GUO Zhanghong， ZHANG Yang， CHEN Yinhai

（Center for Disease Control and Prevention of Shantou City， Shantou 515041， China）

Abstract： Objective： This paper aims to establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of dehydroacetic acid in rice noodles. Method： The samples were added with water， zinc sulfate solution and then adjust pH with sodium hydroxide solution， shake well before ultrasonic extraction， finally the samples were added with water to a constant volume and then centrifuged at a high speed. The supernatant was filtered and then determined by HPLC at 293 nm. Result： Under the condition of mobile phase 0.02 mol·L-1 ammonium acetate∶methanol=90∶10 and the pH value of ammonium acetate adjusted to 8.0， the peak shape of dehydroacetic acid is symmetrical without trailing phenomenon. Within the concentration range of 1～200 μg·mL-1， the linear relationship between the response strength and the concentration of dehydroacetic acid was good， and the linear correlation coefficient of the target substance was 0.999 98. The recovery rates of the samples were 84.3%～106.0%， and the relative standard deviations were 2.37%～2.90%. Conclusion： The method has simple and convenient operation， high accuracy and good reproducibility， and is suitable for the accurate determination of dehydroacetic acid in rice noodles， which is easily to promoted in grass-roots testing institutions and has practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; rice noodles; dehydroacetic acid

脱氢乙酸是一种广谱高效的防腐剂，能杀灭微生物或抑制其繁殖以达到防腐效果，可减缓食品变质，降低经济损失[1]。脱氢乙酸及其钠盐在世界卫生组织化学物毒性分级标准中属于低毒级别，对人体健康存在潜在威胁[2]，因此我国食品安全国家标准规定了脱氢乙酸及其钠盐在食品中的使用范围和最大使用量[3]。尽管有明确规定，但部分食品生产商为了能延长食品保鲜保质时间、追求经济效益最大化，依然会超范围或超剂量使用脱氢乙酸，危害人体健康[4-5]。粿条是潮汕地区的传统特色小吃，深受大众喜爱，含有碳水化合物和蛋白质等丰富的营养成分，极易发生腐败变质，商家为了延长粿条的保质期和保鲜期会添加脱氢乙酸，因此需要对粿条中脱氢乙酸含量进行监测，为消费者的食品安全提供保障。

目前食品中脫氢乙酸的检测方法主要有高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6]、气相色谱法[7]、高效液相串联质谱法[8]等，其中HPLC法能实现对脱氢乙酸的定量分析，且易在基层检测机构中推广。因此，本文以汕头市售粿条为样品，利用HPLC法简单快捷检测脱氢乙酸，为今后高效快速检测粿条或类似样品中的脱氢乙酸提供较强的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品：粿条，购自汕头本地市场。

试剂：脱氢乙酸标准品，CDAA-263002-1g，购自上海安谱公司；硫酸锌溶液（120 g·L-1）：称取120 g硫酸锌，用水稀释至1 L；氢氧化钠溶液（200 g·L-1）：称取200 g氢氧化钠，用水稀释至1 L；乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）：称取1.54 g乙酸铵，用水稀释至1 L；甲醇：色谱纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（配置DAD检测器和OpenLAB工作站）；安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UW220H电子天平，日本岛津科学仪器公司；洁康多功能超声波清洗机；梅特勒托利多pH计；H1850R台式冷冻离心机，湖南湘仪公司；0.22 μm针式水相滤膜，上海安谱公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的建立

准确称取脱氢乙酸标准品0.1 g（精确至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用10 mL氢氧化钠溶液溶解，并用水定容至刻度线得到脱氢乙酸标准储备液（1.0 mg·mL-1）。分别准确吸取脱氢乙酸标准储备液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、10 mL和20 mL，加入100 mL容量瓶中，分别用水定容至刻度线，配制成系列浓度分别为1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的标准工作液。

1.3.2 仪器条件

本实验选用安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱；流动相：0.02 mol·L-1乙酸铵∶甲醇=90∶10；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：293 nm。

1.3.3 样品前处理

用高速均质器均质样品，称取约5 g（精确至0.001 g）样品置于50 mL离心管中，依次加入10 mL水和5 mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液将样品的pH值调节为7～8，摇匀，超声提取20 min，加水定容至50 mL，摇匀，以10 000 r·min-1离心5 min，取适量上清液经0.22 μm水相滤膜过滤后供高效液相色谱仪测定。

1.3.4 流动相pH值的调节

用氢氧化钠溶液将流动相乙酸铵溶液的pH值调节至7.5、8.0、8.5共3个水平，与未调节pH值生成的峰形进行比较，确定合适的流动相pH值。

1.3.5 精密度和准确度

选用基质空白粿条样品作为本底，同一样品设置3份，添加不同浓度的标准溶液，形成3个不同含量的加标水平，按照前处理方法及上机条件进行测定，检测脱氢乙酸的含量。每个浓度做7组平行实验，测定并计算平均回收率和相对标准偏差，从而考察该方法的精密度和准确度。

2 结果与分析

2.1 流动相pH值对脱氢乙酸峰形的影响

由图1可知，没有调节流动相pH值时，目标峰拖尾、峰形不对称，不利于定量分析。将流动相pH值调节至7.5时，峰形有较大改善，拖尾现象也大幅减缓。继续调节流动相pH值至8.0，此时峰形良好，峰尖锐且对称，基本无拖尾现象，能够准确对脱氢乙酸进行定量分析。当流动相pH值继续调节至8.5时，能够看出与pH=8.0时的峰形相比并无显著差别。以上结果表明，该实验中流动相pH值对脱氢乙酸的峰形影响很大，在一定范围内，随着pH值的升高，峰形越好，拖尾现象越不明显。当流动相pH值达到8.0～8.5时，峰形良好，继续升高流动相pH值，峰形无显著变化，考虑保护色谱柱的原则，该实验选择流动相pH=8.0作为最佳实验条件。

2.2 脱氢乙酸标准曲线

将1.3.1配制的脱氢乙酸系列标准工作液按照1.3.2的实验条件上机测定，得到线性回归方程为Y=30.705 52X+3.980 04，其线性相关性系数R2为0.999 98，脱氢乙酸峰面积（响应值）与浓度在1～200 μg·mL-1下呈现良好的线性关系。

2.3 方法精密度和准确度

在基质空白粿条样品（本底值为0）中分别添加0.30 g·kg-1、0.60 g·kg-1、0.80 g·kg-1的脱氢乙酸标准物质，将3组处理好的不同水平的加标粿条样品溶液在上述实验条件下依次上机测定脱氢乙酸含量，根据结果计算平均回收率以及相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表1可知，在该实验条件下测定粿条中脱氢乙酸的加标回收率为84.3%～106.0%，相对标准偏差为2.37%～2.90%，满足定量分析的要求，说明此方法准确度高、重复性好、可信度高。

2.4 样品分析

在汕头当地市场随机抽取了280份新鲜粿条，应用该方法检测脱氢乙酸含量。其中，250份检出有脱氢乙酸，检出率接近90%，说明本地粿条中普遍添加脱氢乙酸。

3 结论与讨论

本实验探讨了利用HPLC法检测粿条中脱氢乙酸的可行性。实验结果表明，在流动相设为0.02 mol·L-1乙酸铵∶甲醇=90∶10，调节流动相pH值至8.0时，能有效分离脱氢乙酸与其他干扰峰，改善脱氢乙酸的峰形，缓解拖尾现象，说明流动相pH值对脱氢乙酸的峰形有重要影响。脱氢乙酸解离常数（pKa）为5.4[9]，流动相的理论pH值大于pKa值+2或小于pKa值-2时能以分子形式或离子形式稳定存在，因此实验时可根据样品种类不同调节脱氢乙酸流动相的pH值为8.0～8.5，从而获得良好的分析效果。对粿条进行的加标回收试验，得到的加标回收率为84.3%～106.0%，相对标准偏差为2.37%～2.90%，说明此方法具有一定可操作性，可准确测定粿条样品中脱氢乙酸的含量。

汕头市售粿条脱氢乙酸的检出率高，脱氢乙酸添加情况普遍，相关食品安全部门应加强监管，确保防腐剂的适量、科学添加，为这一传统食品的健康发展提供强有力的支撑，保障消费者的食品安全。

参考文献

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[2]张蒙，陈新，张雨梅.脱氢乙酸钠对大鼠成骨细胞增殖、分化和矿化的影响[C]//第十次全国毒理学大会论文集.北京：中国毒理学会，2023：1.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

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[5]刘峰，徐飞，袁秀娟，等.一起牛奶中脱氢乙酸钠中毒事件调查分析[J].中国食品卫生杂志，2019，31（5）：490-493.

[6]梁健华，谢珊婷，陈雪明.一种快速测定食醋和酱油中脱氢乙酸含量的高效液相色谱法[J].中国食品添加剂，2023，34（1）：313-319.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定：GB 5009.121—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[8]李梅，陳浩明，关智维.液相色谱串联质谱仪对食品中10种甜味剂和防腐剂的检测[J].广东化工，2021，48（8）：271-274.

[9]SCORDINO M，LAZZARO F，BORZI M A，et al.Dehydroacetic acid in cheese and cheese coating，results of official control in Italy[J].Food Additives & Contaminants，2018，11（1）：75-81.