营养强化对红螯螯虾抱卵及胚胎营养成分影响研究

■ 刘 漫 程 顺 郑连宝 张 旭 章美芳 沈 佳 迟美丽 李 飞*

（1.浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江湖州 313001；2.德清县食品药品检验检测中心，浙江湖州 313200）

红螯螯虾（Cherax quadricariratus）俗称澳洲淡水龙虾、小青龙，是世界性淡水名贵经济虾类之一，目前其繁育方式主要有室内水泥池繁育与室外土塘繁育，其中包括浙江省在内的非热带地区更趋向于室内水泥池繁育，该方式的出苗量更高、更稳定，且环境可控，集约化程度高，特别是对于红螯螯虾这一热带品种更适宜[1-3]。但因该虾抱卵量少、孵化率低、出苗量不足，且规模化育苗技术滞后，导致目前其苗种供应紧张，亟需针对性解决其大规模繁育中的技术瓶颈问题。

营养强化，即保证亲本的营养充足供给，既是提高亲本抱卵量及虾苗孵化率和成活率的物质保证，也是保证胚胎正常发育和开口前幼体营养需求的基础[4-5]。亲本饵料中充足的营养和能量对于其性腺的成熟是必要的，并影响卵巢的组成和卵子的质量[6]。在亲虾性腺发育前，体内储存的主要营养物质是蛋白质、氨基酸和脂类物质（以磷脂为主），这些营养物质在性腺发育时会迅速转移至性腺加以利用[7-9]，其中蛋白质主要用于性腺发育，脂类主要满足能量需求[10]。通讯螯虾（Pacifastacus leniusculus）雌虾饵料中应含有足够的蛋白质和必需氨基酸，以满足其生长和卵黄发育的需要[11]。使用蛋白质含量较高的饵料可明显提高红螯螯虾产卵效果[12]。除蛋白质外，性腺发育还受饵料中脂类、类胡萝卜素等物质影响[13]。脂质是最重要的能量物质，它们的氧化分解可用于饥饿或繁殖过程中的能量消耗[14]。性腺的脂质需求部分来自饵料，因为自身肝胰腺的脂质储备不能满足卵巢需求[15]。类胡萝卜素对红螯螯虾性腺发育也起着至关重要的作用[16]，类胡萝卜素（β-胡萝卜素和虾青素）与卵母细胞发育相关，繁育期间饵料中应补充类胡萝卜素[17]。对繁殖期亲虾投喂多种混合饵料，亲虾体内的营养物质会加速积累，有利于雌虾的抱卵，可明显改善亲虾性腺再成熟和产卵能力，再次产卵所需时间也会缩短[18-19]。每日补充螺蛳肉和鱼肉，红螯螯虾卵的质量与抱卵量均会提高[20]。投喂动物性饵料的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）雌虾性腺发育状况明显好于投喂配合饲料[21]。美国龙虾（Homarus americanus）繁殖期间应加强投喂动物性饵料，为虾提供充足的营养[22]。植物性和动物性饵料混合喂养更有利于促进克氏原螯虾卵巢发育[23]。因此，富含蛋白质、脂类等的动物性饵料与富含类胡萝卜素等的植物性饵料的充足供给是保证亲虾性腺成熟度与卵质量的营养基础。

胚胎发育所需的蛋白质和氨基酸均直接来源于卵黄物质的逐渐水解，蛋白质和氨基酸含量的变化可进一步促进各种组织与器官的形成。在红螯螯虾整个胚胎发育过程中，总蛋白的含量大致呈直线下降趋势，总氨基酸的含量变化则呈抛物线状。在红螯螯虾的胚胎发育过程中，卵内营养物质不断地进行着异化和同化作用，一部分的蛋白质用于构建组织与器官，另一部分的蛋白质为胚胎发育提供能量[24]。红螯螯虾胚胎发育有代表性、发育时间长的阶段分别为黄卵期（原肠期至5 对附肢期，呈黄色的卵）、桔卵期（7 对附肢期至18对附肢期，呈桔色的卵）[25]。

本研究通过在饵料中使用一定比例的带鱼、螺蛳肉、胡萝卜等营养强化红螯螯虾亲本，探讨营养强化对其抱卵效果及胚胎质量的影响，并分别探讨有代表性的黄卵期、桔卵期胚胎指标，用于指导亲虾培育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用红螯螯虾来自浙江省淡水水产研究所德清试验基地，所用虾体质健康、四肢齐全，规格基本一致。

1.2 养殖试验方法

将亲虾以雌雄比为4∶1 的比例放入养殖槽内，每个槽放入10尾虾[8雌虾2雄虾，平均体重为（67.26±4.98） g]，设置3 组饵料类型，每期3 个重复。1 组：每日早、晚各投喂一次饲料，早上投喂量为虾总重的2%，傍晚投喂量为虾总重的4%；2 组：早上投喂饲料，投喂量为虾总重的2%，傍晚投喂顺序为第1 日带鱼、第2 日配合饲料+胡萝卜、第3日螺蛳肉、第4日配合饲料、第5 日带鱼、第6 日配合饲料+胡萝卜、第7 日配合饲料，7 日重复1 次，傍晚饲料、胡萝卜投喂量为虾总重的4%，带鱼、螺蛳肉投喂量为虾总重的8%；即每周带鱼、螺蛳肉、胡萝卜与配合饲料的总投喂量比例为2∶1∶1∶3.75；3 组：早上投喂饲料，投喂量为虾总重的2%，傍晚每日的投喂顺序为第1日带鱼、第2日配合饲料+胡萝卜、第3 日带鱼、第4 日螺蛳肉、第5 日带鱼、第6 日配合饲料+胡萝卜、第7 日螺蛳肉，7 日重复1次，傍晚饲料、胡萝卜投喂量为虾总重的4%，带鱼、螺蛳肉投喂量为虾总重的8%；即每周带鱼、螺蛳肉、胡萝卜与配合饲料的总投喂量比例为3∶2∶1∶2.75。

隔日吸污换水，各组环境条件均相同，保证培育环境的溶氧、温度、水质状况良好及一致。试验期共30 d。

1.3 抱卵指标检测

交配30 d 后抓取抱卵虾，统计各组的抱卵指标，包括抱卵率、绝对怀卵量（平均每尾抱卵虾怀卵数量，粒/尾）、相对怀卵量、畸形胚胎比例，检测分析不同营养储备下雌虾的抱卵状况。

抱卵率（%）=抱卵虾数量/雌虾数量×100

相对怀卵量（粒/g）=绝对怀卵量/雌虾体质量

畸形胚胎比例（%）=畸形胚胎数量/总胚胎数×100

1.4 胚胎指标检测

剥离各组抱卵虾的胚胎（黄卵期及桔卵期胚胎）进行分析，包括：①胚胎总体指标：检测各组胚胎的湿重、干重及总蛋白、总脂含量，分析不同营养储备下雌虾抱卵后胚胎的基本状况；②营养成分分析：分析各组胚胎内氨基酸（必需与非必需氨基酸）及脂肪酸含量，分析不同营养储备下雌虾产卵后胚胎的营养状况。

1.5 数据分析

试验数据分析采用Excel 软件完成，统计结果以“平均值±标准差（X±SD）”表示。以P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 抱卵指标

由表1 可知，2、3 组红螯螯虾的抱卵率、相对怀卵量均显著高于1 组（P<0.05），红螯螯虾绝对怀卵量、畸形胚胎比例则3 组之间均无显著差异（P>0.05），2、3组红螯螯虾的各指标则均无显著差异（P>0.05）。

表1 抱卵指标

2.2 胚胎总体指标

由表2 可知，黄卵期胚胎的湿重、干重与桔卵期胚胎无显著差异（P>0.05），但黄卵期胚胎的总蛋白含量均显著低于桔卵期胚胎（P<0.05），总脂含量则均显著高于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黄卵期胚胎各组之间的湿重、干重、总蛋白及总脂含量均无显著差异（P>0.05）。桔卵期胚胎各组之间的湿重、干重及总脂含量均无显著差异（P>0.05），但桔卵期胚胎中1 组的总蛋白含量显著低于2、3 组（P<0.05），2、3 组之间的总蛋白含量无显著差异（P>0.05），但总体上桔卵期胚胎中3组的总蛋白含量略高。

表2 胚胎总体指标

2.3 胚胎氨基酸含量

由表3 可知，必需氨基酸含量比较中，黄卵期胚胎的必需氨基酸含量（除苯丙氨酸外）均显著低于桔卵期胚胎（P>0.05）。另外，黄卵期胚胎各组之间均无显著差异（P>0.05）。桔卵期胚胎中，3 组的必需氨基酸含量均显著高于其他两组（P<0.05），其中1 组赖氨酸含量显著低于2 组（P>0.05），其他必需氨基酸含量1、2组间则无显著差异（P>0.05）。

表3 胚胎必需氨基酸含量（mg/g干物质）

由表4 可知，非必需氨基酸含量比较中，黄卵期胚胎的天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、胱氨酸含量均显著低于桔卵期胚胎（P<0.05），但黄卵期胚胎的精氨酸含量则显著高于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黄卵期胚胎中，1 组的胱氨酸含量显著低于2、3组（P<0.05）；1、2 组中的酪氨酸显著低于3 组（P<0.05）。桔卵期胚胎的非必需氨基酸含量中，3 组的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸含量显著高于1、2 组（P<0.05）；3 组的甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸含量显著高于1组（P<0.05）。

表4 胚胎非必需氨基酸含量（mg/g干物质）

2.4 胚胎脂肪酸含量

由表5、表6 可知，黄卵期胚胎的C15∶0、C18∶3n-6、C20∶5n-3（EPA）显著高于桔卵期胚胎（P<0.05），黄卵期胚胎中2、3 组的C22∶6n-3（DHA）显著高于桔卵期胚胎（P<0.05），而C20∶3n-3 则显著低于桔卵期胚胎（P<0.05）。另外，黄卵期胚胎中，1 组的C14∶0 显著高于2 组（P<0.05），1 组的C18∶3n-3 显著低于2 组（P<0.05），2 组的C20∶4n-6、C23∶0 显著高于其他两组（P<0.05），3组的EPA、DHA显著高于其他两组（P<0.05）。桔卵期胚胎中，1 组的C17∶0、C17∶1n-7、C18∶0、C18∶1n-9、C18∶2n-6、C18∶3n-3、C20∶4n-6、C20∶3n-3、EPA 显著低于其他两组（P<0.05），但1 组的C20∶0、C20∶2n-6 显著高于其他两组（P<0.05）。

表5 胚胎脂肪酸含量（mg/g干物质，C14∶0～C20∶0）

表6 胚胎脂肪酸含量（mg/g干物质，C20∶1～C22∶6n-3）

3 讨论

饵料能否满足一定的蛋白质或氨基酸供应对保证亲虾的正常繁殖具有重要意义[26-27]。研究表明，在饵料中补充鱼肉和螺蛳肉等动物性饵料，有助于雌虾性腺发育，可提高红螯螯虾抱卵率与怀卵量[20-23]。本次研究结果显示，2、3组红螯螯虾的抱卵率、相对怀卵量均显著高于1组，这与上述研究结果一致。

本次试验中，胚胎总脂质含量随胚胎发育而降低，推测是卵黄中大量脂质被不断分解，为新组织、新器官的形成和生长提供物质和能量基础。有研究显示，胚胎从黄卵期发育至桔卵期的过程中，是各组织与器官分化和形成的关键时期，该阶段胚胎新陈代谢旺盛，所以脂质可能为该阶段的各项生理活动提供较多能量[25，28]。胡先成等[29]的研究也指出，河川沙塘鳢的胚胎发育至眼黑色素期出现时，其细胞、组织分化速度加快，脂质被大量利用，造成胚胎内脂质的含量急剧降低。本试验还发现，EPA 和DHA 等关键脂肪酸含量随胚胎发育的深入而下降，可能是因为同属于ω-3 系列不饱和脂肪酸，为重要的多不饱和脂肪酸，是动物发育的必需脂肪酸，其含量随胚胎发育的深入而下降，可能与这两种脂肪酸有调节神经系统发育及作为主要能源维持胚胎发育的作用有关。

同时，卵黄的营养物质主要是卵黄蛋白和脂质，本试验中，与脂质的变化趋势不同，胚胎发育过程中，总蛋白含量明显增加。这可能是因为在胚胎发育与各组织、器官的不断形成过程中，需要蛋白质的快速合成。因此推测从黄卵期发育至桔卵期过程中，主要消耗脂质作为能量，并积蓄大量蛋白质，这些积累的蛋白质将用于桔卵期之后的胚体发育与胚胎孵化。

另外，本研究中，桔卵期2、3 组的总蛋白含量显著高于1 组，这是由于蛋白质不但是细胞的结构物质，而且是细胞生理代谢的重要能源物质之一，在胚胎发育及苗种孵化中较为重要[30]。因此，通过营养强化使总蛋白含量显著增加有利于胚胎和幼体的发育。而蛋白质的营养价值又取决于氨基酸，特别是必需氨基酸的组成与含量[30]。另外，有研究表明，必需氨基酸中的亮氨酸、异亮氨酸可分解成乙酰CoA 和乙酰乙酸，两者均是沟通糖类与脂类代谢的重要中间物质[31]；非必需氨基酸中的谷氨酸与排氨有关，另外谷氨酸在酶的催化下，可生成相应的α-酮戊二酸，而α-酮戊二酸又是三羧酸循环的关键中间代谢产物[32-33]，而精氨酸可参与肌酸的合成，在能量代谢中起重要作用[33]。因此，异亮氨酸与谷氨酸含量的提高对胚胎的顺利发育具有积极作用。本研究中，桔卵期胚胎中，3组胚胎内的异亮氨酸等必需氨基酸及谷氨酸、精氨酸等非必需氨基酸含量均显著高于其他两组，说明带鱼、螺蛳肉、胡萝卜等比例的适当增加可显著提高胚胎的必需氨基酸含量，对胚胎发育具有积极意义。

脂类对胚胎的正常孵化极为重要。幼体在开口前无外源性营养的摄入，仅能依靠胚胎中已有脂肪作为能源以实现孵化[34]。胚胎中的脂肪由亲虾性腺发育过程中的饵料所提供，因此保证足够的营养有利于胚胎质量的提高[35]。本研究表明，EPA 与DHA等脂肪酸含量基本为1 组的低于其他两组，由于虾蟹类脂肪酸中的EPA 与DHA 能够用于合成磷脂，磷脂能促进胆固醇（合成蜕皮激素的前体物质）的吸收和利用，间接影响了虾蟹类幼体的蜕壳与提高幼体存活率，这也有利于胚胎发育[36]。胚胎中EPA 水平与亲虾产卵量、DHA 水平与受精卵孵化率之间分别存在着正相关关系[37]。本研究中，黄卵期3 组的EPA、DHA 显著高于其他两组（P<0.05）。桔卵期2、3 组的EPA 等大部分脂肪酸显著高于1 组（P<0.05），结合抱卵率、相对怀卵量、总蛋白含量等也是2、3 组显著高于1 组，说明单纯只投喂饲料可能不足以最大程度提高胚胎发育的效果，因此有必要混合添加动物性和植物性饵料。

4 结论

试验结果表明，胚胎从黄卵期发育为桔卵期，总蛋白含量升高，总脂含量则降低，可能与器官的生成及之后胚体发育与胚胎孵化有关。同时，每周带鱼、螺蛳肉、胡萝卜与配合饲料的总投喂量比例为3∶2∶1∶2.75 或2∶1∶1∶3.75 进行红螯螯虾亲本的营养强化，有助于提高亲本抱卵率、相对怀卵量、胚胎总蛋白含量、大部分氨基酸与脂肪酸含量，促进亲虾的性腺发育，其中每周带鱼、螺蛳肉、胡萝卜与配合饲料的总投喂量比例为3∶2∶1∶2.75有助于提高黄卵期胚胎的EPA与DHA含量。