球孢白僵菌及酶增效剂对松墨天牛幼虫的毒力测定

杨梅,石艳,石博文,陈玲,杨桦*

1.南江县林业局,四川 南江 635600；2.康定市林业和草原局,四川 康定 626000；3.四川农业大学林学院,四川 成都 611130

松材线虫，原产于北美，是国际性的检疫有害生物。由该线虫引起的松材线虫病，是目前全世界最严重的林业病害之一。该病主要靠媒介昆虫传播，而松墨天牛是其主要的媒介昆虫之一。松材线虫会通过气孔进入松墨天牛体内，松墨天牛羽化后携带大量的线虫，在进行补充营养或产卵时将线虫传播到健康的松树上。因此，防治该媒介昆虫具有重大的意义。

白僵菌由于其寄主范围较广、适应性和致病性较强等特点，逐渐成为农林害虫生物防治中应用最多的虫生真菌之一[1-3]。白僵菌可寄生包括鳞翅目、鞘翅目、同翅目等15 目的149 科521 属的700 多种昆虫。白僵菌属的球孢白僵菌作为子囊菌中的虫生真菌广泛地存在于环境中。目前已有大量报道证明球孢白僵菌防治松墨天牛是完全可行的。国内也在松墨天牛白僵菌资源方面进行了一些研究，筛选出了许多高毒力菌株[4-6]。然而只有来源于松墨天牛的球孢白僵菌在松墨天牛幼虫上进行继代移植后其毒力会得到增强，而在自然界中存在着许多来源于非松墨天牛的球孢白僵菌。因此探寻一种提高来源于非松墨天牛的球孢白僵菌对松墨天牛毒力的方法在对松墨天牛的生物防治中具有重要意义。

白僵菌对寄主的入侵是酶和机械压力共同作用的结果[2]，在孢子萌发和入侵时都会分泌出一系列胞外水解酶来分解昆虫表皮，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和几丁质酶等[7-9]。张旦妮等[10]将球孢白僵菌孢子悬浮液与其蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶液混合后对松墨天牛幼虫进行毒力测定，发现蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶无论是对来自松墨天牛还是来自松毛虫的白僵菌的毒力均有极显著的增效作用。因此在球孢白僵菌制剂中加入酶产品作为增效剂以提高其杀虫效果，这可能为提高来源非松墨天牛的白僵菌对松墨天牛的毒力开辟一种新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫

松墨天牛：于2020 年10 月在四川省富顺县国有林场通过剖开枯死木采集松墨天牛4 龄幼虫。挑选健康、大小一致的幼虫放入装有人工饲料的50 mL的离心管中，每管一头，并将盖头钻孔，以便通气，最后放入25℃的人工气候箱中饲养。

1.1.2 供试菌株

菌株来源：供试球孢白僵菌菌株于2021 年在四川省富顺县国有林场采集，为木芙蓉上的棉大卷叶螟（Sylepta derogata）自然感病球孢白僵菌，在室内通过PDA 培养基纯化分离获得。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬浮液的制备

将球孢白僵菌菌株接种到PDA 培养基上，放入25℃、75%湿度条件下的人工气候箱中培养14d，让其充分产孢后，用无菌水将孢子粉洗入50 mL 0.1%的吐温-80 无菌水溶液中，在磁力搅拌器上充分搅拌，等到孢子均匀分散后，即得到孢子悬浮液。在显微镜下用血球计数板计算孢子数量，得到初始浓度，最后稀释相应的倍数配成浓度为1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL 的孢子悬浮液。

1.2.2 球孢白僵菌对松墨天牛幼虫的毒力测定

采用浸渍法[11]：选取活力高、大小一致的松墨天牛的4 龄幼虫作为供试幼虫。用镊子夹取幼虫，头部朝上，将胸部以下部分分别浸入1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL 的孢子悬浮液内，接种3s 便挑出，以浸0.1%的吐温-80 无菌水为对照（CK）。各处理设3 个重复，每一重复接种20 头。将接种后的松天牛幼虫放入离心管中培养14 d。每日观察并记录天牛幼虫的发病过程、死亡情况。

1.2.3 酶液的制备

分别取1 ml 的1×108cfu/mL 的球孢白僵菌孢子悬浮液放入含100 mL 诱导蛋白酶、诱导脂肪酶培养基的锥形瓶中，在25℃、150 r/min 的条件下，在旋转式摇床上培养5 d，3 层滤纸过滤，所得滤液即为蛋白酶液和脂肪酶液。几丁质酶液则需要在27℃、200 r/min 的条件下，在旋转式摇床上培养7 d，经3 层滤纸过滤后得到。

1.2.4 酶液对球孢白僵菌毒力的影响试验

将3 种酶液经0.22 μm 的滤头过滤，按1:1 的比例分别与1×108cfu/ml 的球孢白僵菌孢子悬浮液均匀混合，记为Ⅱ液。其中，蛋白酶液、脂肪酶液、几丁质酶液分别记为Ⅱ（蛋）、Ⅱ（脂）、Ⅱ（几）。同时，将过滤后的酶液，放入灭菌锅中，以使三种酶液丧失酶活性，同样按1:1 的比例分别与1×108cfu/ml的孢子悬浮液均匀混合，记为Ⅲ液。将1×108cfu/ml的孢子悬浮液记为Ⅰ液。以0.1%的吐温-80 无菌水为对照，分别测定Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液对松墨天牛幼虫的毒力，从而筛选出对球孢白僵菌毒力增效最好的酶。

1.2.5 数据处理

运用SPSS27.0 和Excel2010 进行数据统计和分析，计算不同浓度孢子悬浮液对松墨天牛4 龄幼虫的累计死亡率和僵虫率，并计算添加了酶液的孢子悬浮液对松墨天牛4 龄幼虫的校正死亡率、毒力回归方程、相关系数、LT50和95%置信限度等，并用LDS 法对进行差异显著性分析。运用Excel2010 绘制相应的图表。

2 结果与分析

1.1 材料

2.1.1 不同浓度球孢白僵菌对松墨天牛4 龄幼虫的累计死亡率

1×105，1×106，1×107和1×108cfu/mL 的孢子悬浮液对松墨天牛4 龄幼虫的累计死亡率测定结果见图1。由图可以看出，从第4 d 开始，不同浓度孢子悬浮液处理的天牛幼虫开始出现死亡，但累计死亡率差异不大。第5 d 时，1×106，1×107和1×108cfu/mL孢子悬浮液的累计死亡率开始快速增加，而1×105孢子悬浮液的累计死亡率增长速率较小。第10 d 时，1×108cfu/mL 孢子悬浮液的累计死亡率达到100%。第13 d 时，1×107孢子悬浮液的累计死亡率达到100%。当试验结束时（14 d），1×105，1×106，1×107和1×108cfu/mL 的孢子悬浮液的累计死亡率分别为26.7%、61.7%、100%、100%。所以从天牛幼虫的致死效果来讲，1×107和1×108cfu/ml 浓度要优于1×105和1×106cfu/mL。

图1 不同浓度球孢白僵菌对松墨天牛4 龄幼虫的累计死亡率Fig.1 Cumulative mortality rate of B.bassiana at different concentrations on the 4th instar larvae of M.alternatus

2.1.2 不同浓度球孢白僵菌对松墨天牛4 龄幼虫的僵虫率

由图2 可知，僵虫率随着浓度的降低而减小。1×108cfu/mL 浓度的僵虫率最高，为88.3%；其次为1×107cfu/mL，为83.3%；僵虫率最低的是1×105cfu/mL，为18.3%。1×108和1×107cfu/mL 浓度的僵虫率差异不显著（P>0.05），1×106和1×105cfu/mL浓度的僵虫率差异显著（P<0.05），而1×106和1×105cfu/mL 浓度的僵虫率显著低于1×108和1×107cfu/mL（P<0.05）。

图2 不同浓度球孢白僵菌对松墨天牛4 龄幼虫的僵虫率Fig.2 Infection rate of B.bassiana at different concentrations on the 4th instar larvae of M.alternatus

经过对4 种浓度球孢白僵菌的孢子悬浮液对松墨天牛4 龄幼虫的累计死亡率和僵虫率的比较分析，1×108cfu/ml 为最佳浓度。

2.2 酶液对球孢白僵菌毒力的增效作用

2.2.1 不同酶液对松墨天牛4 龄幼虫的校正死亡率

1×108cfu/mL 的球孢白僵孢子悬浮液（Ⅰ型）、孢子悬浮液+酶液（Ⅱ型）、孢子悬浮液+灭活的酶液（Ⅲ型）3 种液体对松墨天牛4 龄幼虫的校正死亡率测定结果见表1。Ⅱ型（几）溶液处理后的幼虫第2d 便开始出现死亡，而Ⅱ型（蛋），Ⅱ型（脂）分别在第3d，第4d 开始死亡。第8d 时，Ⅱ型（蛋）的校正死亡率首先达到100%，Ⅱ型（脂）、Ⅱ型（几）第9d 校正死亡率达到100%，而Ⅰ型第10d 才达到。各溶液的校正死亡率达到100%之前，当处理时间相同时，蛋白酶、脂肪酶和几丁质酶的Ⅱ型溶液的校正死亡率均大于Ⅲ型；蛋白酶和几丁质酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的校正死亡率均大于Ⅰ型；而脂肪酶的Ⅱ型溶液，除第4d 和Ⅰ型的校正死亡率相同均为10.0%外，校正死亡率均大于Ⅰ型。脂肪酶的Ⅲ型溶液，除第5d 和Ⅰ型的校正死亡率相同均为15.5%外，校正死亡率均小于Ⅰ型。

表1 不同酶液对松墨天牛4 龄幼虫的校正死亡率Tab.1 Adjusted mortality of 4th instar larvae of M.alternatus atdifferent enzyme solutions

2.2.2 不同酶液对松墨天牛4 龄幼虫的半致死时间

由表2 可知，Ⅲ型（脂）的LT50最大，为6.97 d；Ⅱ型（蛋）的LT50最小，为5.50 d。蛋白酶和几丁质酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的LT50均小于Ⅰ型溶液，且差异性显著（P<0.05）。同时，蛋白酶和几丁质酶的Ⅱ型溶液的LT50也都显著地小于Ⅲ型溶液的LT50（P<0.05），表明蛋白酶和几丁质酶对球孢白僵菌的毒力都有显著的增效作用。而脂肪酶的Ⅱ型和Ⅲ型溶液的LT50与Ⅱ型溶液的LT50差异性并不显著（P>0.05），表明脂肪酶对球孢白僵菌毒力增效作用并不显著。蛋白酶的Ⅱ型溶液的LT50显著的小于几丁质酶的Ⅱ型溶液的LT50（P<0.05）。因此，蛋白酶对球孢白僵菌毒力的增效作用强于脂肪酶。

表2 不同酶液对松墨天牛4 龄幼虫的半致死时间Tab.2 LT50 of different enzyme solutions on the 4th instar larvae of M.alternatus

3 结论与讨论

用白僵菌防治松墨天牛是最有前景的松材线虫病生物防治的方法之一。但是，陶园媛等[12]从松墨天牛幼虫上分离出2 株白僵菌对川硬皮肿腿蜂（Scleroderma sichuanensis）进行毒力测定，发现其毒力相差较大，因此同一寄主上分离出的不同菌株的毒力可能有较大的差异。而且同一菌株对不同的寄主的毒力差异也可能较大：经多年生产筛选的防治松毛虫的优良菌株对于松墨天牛幼虫却属于低毒力菌株[13]，不同菌株对害虫寄生具有一定的专一性。因此可以通过在球孢白僵菌制剂中加入酶产品作为增效剂以提高其杀虫效果。

在本实验中，通过对比接种不同浓度的球孢白僵菌孢子悬浮液后的松墨天牛幼虫的累计死亡率和僵虫率发现，接种高浓度球孢白僵菌孢子悬浮液的松墨天牛幼虫的累计死亡率和僵虫率最高，而低浓度的孢子悬浮液对松墨天牛幼虫也有一定的侵染性，说明球孢白僵菌孢子悬浮液对松墨天牛幼虫的毒力受浓度的影响，浓度越高，毒力越强。这与郭涵[14]等研究孢悬液浓度对球孢白僵菌对松墨天牛幼虫的致病力的影响的结果一致。因此选择1×108cfu/mL为防治最佳浓度。将3 种酶液和孢子悬浮液混合后对松墨天牛4 龄幼虫进行毒力测试，可以发现，蛋白酶液的LT50最小，为5.50 d，对球孢白僵菌毒力的增效作用最好。因此选择蛋白酶液为最佳增效剂。本实验所用的球孢白僵菌菌株并非来源于松墨天牛，而是从感病的棉大卷叶螟上分离得到的，其1×108cfu/mL 的孢子悬浮液的LT50为6.76 d，添加了蛋白酶液的孢子悬浮液LT50为5.50 d。林海萍[15]等认为来源于松墨天牛的球孢白僵菌菌株B5为高毒力菌株，LT50为5.63 d。因此，即使是来源于非松墨天牛上的菌株，添加蛋白酶液作为增效剂，其毒力也能达到来源于松墨天牛的高毒力菌株的水平。因此本实验的结果，为如何增效来源非松墨天牛上的球孢白僵菌对松墨天牛的毒力来防治松墨天牛提供新的思路，为用酶作为增效剂提高球孢白僵菌毒力奠定理论基础。