3味山姜属中药黄酮类成分对大鼠环核苷酸水平及交感神经-肾上腺轴的影响

秦华珍 谢旭格 黄少敏 牛新迈 戴庆玲 柳俊辉

(广西中医药大学,南宁,530200)

高良姜AlpiniaofficinarumHance,大高良姜AlpiniagalangalWilld.,红豆蔻AlpiniagalangalWilld.3味山姜属中药都是性味辛温(热),主归脾胃经,属于温里药,具有温中散寒、燥湿、行气止痛、止呕止泻等功效,临床上主治脘腹冷痛[1]。有研究者发现黄酮类成分是该属植物的主要活性成分之一[2-3]。已有研究表明有些中药的拆分组分与其全成分具有相似的作用,与其药性属性相符合[4-7]。有研究证实一些温热药可以提高机体的基础代谢率,或对环核苷酸水平和自主神经系统有调节作用[8]。本文提取3味山姜属中药黄酮类成分,复制胃溃疡寒证大鼠模型,测定胃组织中腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase,AC)、磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase2,PDE2)、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)、环磷酸鸟苷(Cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP)的含量及血清中促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic Hormone,ACTH)、多巴胺β羟化酶(Dopamine Beta-Hydroxylase,D-β-H)的含量,研究3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠环核苷酸水平及交感神经-肾上腺轴ACTH、D-β-H的影响,探讨黄酮类成分的药性归属,寻求3味山姜属中药温热药性的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,180～220 g,5周龄,90只,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2016-0002。饲养于广西中医药大学动物房,大鼠自由饮水,以标准普通饲料喂食,室内环境温度16 ℃,本实验经广西中医药大学伦理委员会审查批准(伦理审批号:DW20210311-021)。

1.1.2 药物 高良姜、大高良姜、红豆蔻均购自安国市冷背药材有限公司,批号:20181018;知母购于广东汇群中药饮片股份有限公司,批号:20200412;以上药材均由广西中医药大学中药鉴定学教研室马雯芳教授鉴定,高良姜为姜科山姜属植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根;大高良姜为姜科山姜属植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的干燥根;红豆蔻为姜科山姜属植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的果实;知母为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎。

1.1.3 试剂与仪器 石油醚(60～90 ℃)(天津市富宇精细化工有限公司,批号:20190310);乙醇(西陇化工股份有限公司,批号:20190316);氢氧化钠(海麦克林生化科技有限公司,批号:C10492126);冰乙酸(成都市科隆化学品有限公司,批号:20200201);盐酸(西陇化工股份有限公司,批号:20190316);聚山梨酯-80(吐温80)(麦克林,批号:C10794975);ACTH、D-β-H、腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase,AC)、PDE2、cAMP、cGMP)酶联免疫吸附试验检测试剂盒均购于Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司,批号分别为:202007、202007、202010、202010、202010、202010。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与模型制备 取SPF级雄性SD大鼠90只,随机取10只为空白组,其余各组造模,造模成功后简单随机化选取10只为模型组,其余70只随机分为:干姜姜辣素组、高良姜高剂量组、高良姜低剂量组、大高良姜高剂量组、大高良姜低剂量组、红豆蔻高剂量组、红豆蔻低剂量组,共7组,每组10只。沿用前期研究的造模方法,每天早上灌服冰知母水煎液(剂量10.44 g/kg,生药量0.5 g/mL,给药量2 mL/100 g,温度4 ℃),下午灌服15%冰乙酸溶液1 mL,1次/d,连续给药4 d。

1.2.2 给药方法 造模药物的制备:取知母1 kg,加10倍量的纯水浸泡1 h后煮沸,保持微沸1 h,纱布过滤,收集滤液,滤渣加入8倍量纯水煮沸40 min,纱布过滤,收集滤液,合并2次滤液,加热浓缩至生药浓度为0.5 g/mL浓度,静置至常温,保存至4 ℃冰箱备用。冰乙酸溶液的制备:取一定量的99.5%冰乙酸,加入纯水稀释得到15%冰乙酸溶液。

受试药物的制备:取适量高良姜、大高良姜、红豆蔻饮片分别粉碎成粗粉,依次加入40倍量95%、60%乙醇,每次回流提取4 h,过滤,合并所得的滤液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味。将粗提物加适量的水混匀,煮沸,加入1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10～11,煮沸1 h,过滤,重复2次,合并滤液,滤液加入1 mol/L盐酸溶液调节pH值至1～2,水浴保温30 min,放置24 h,析出沉淀,离心,弃去上清液,沉淀用蒸馏水抽洗2～3次,40 ℃真空干燥,得到高良姜、大高良姜、红豆蔻黄酮提取物,备用,用时以0.5%吐温80溶液配成相应浓度。

阳性药物的制备:称取适量干姜姜辣素,以0.5%吐温80溶液溶解,制备得到4.5 mg/mL(给药体积为1 mL/200 g)干姜姜辣素溶液,备用。造模结束后第2天开始给药,空白组、模型组灌服0.5%吐温80溶液,阳性组灌服干姜姜辣素溶液,各受试药物组灌服相应高低剂量组溶液,给药体积均为1 mL/100 g,每12 h给药1次,共给药4次[9],低剂量组给药量相当于生药量2.2 g/kg,高剂量组给药量相当于生药量8.8 g/kg。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠胃组织AC、PDE2、cAMP、cGMP含量测定 末次给药后,禁食不禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,剂量为0.5 mL/100 g,剖开大鼠腹部,沿腹腔剪开,剥离胃,沿胃大弯剪开,用生理盐水清洗去除食物残渣,剪取胃溃疡病灶及周围组织约1 g,加入冰生理盐水,制备10%组织匀浆,3 000 r/min离心15 min(离心半径16.5 cm),分取上清液,备用,参照试剂盒方法测定大鼠胃组织AC、PDE2、cAMP、cGMP含量。

1.2.3.2 大鼠血清ACTH、D-β-H含量测定 末次给药后,禁食不禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,剂量为0.5 mL/100 g,腹主动脉采血,静置数小时使血清析出,3 000 r/min离心15 min(离心半径16.5 cm),分离血清,于-80 ℃冰箱冻存,备用,参照试剂盒方法测定大鼠血清ACTH、D-β-H含量。

2 结果

2.1 对胃溃疡寒证大鼠胃组织环核苷酸水平的影响 与空白组比较,模型组大鼠胃组织AC含量降低、PDE2含量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,高良姜、大高良姜、红豆蔻高低剂量组大鼠胃组织AC含量升高,高剂量组及低剂量组差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);高良姜、大高良姜、红豆蔻高低剂量组大鼠胃组织PDE2含量降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表1。与空白组比较,模型组大鼠胃组织cAMP含量与cAMP/cGMP比值降低,差异有统计学意义(P<0.01);cGMP含量差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,高良姜、大高良姜、红豆蔻高低剂量组大鼠胃组织cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高。其中高良姜低剂量组的cAMP含量及cAMP/cGMP比值差异有统计学意义(P<0.05),大高良姜低剂量组cAMP/cGMP比值差异有统计学意义(P<0.05),其余各组差异均有统计学意义(均P<0.01);cGMP含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织AC、PGE2含量的影响

表2 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响

2.2 对胃溃疡寒证大鼠ACTH、D-β-H的影响 与空白组比较,模型组大鼠的血清ACTH、D-β-H含量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各给药组血清ACTH、D-β-H含量均升高。在升高ACTH含量方面,与模型组比较,大高良姜高低剂量组差异有统计学意义(P<0.01),其他组差异均有统计学意义(均P<0.05);在升高D-β-H含量方面,与模型组比较,高良姜与红豆蔻高剂量组、大高良姜高低剂量组差异均有统计学意义(均P<0.01),高良姜与红豆蔻低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影响

3 讨论

胃溃疡是指胃黏膜被自身消化,从而形成溃疡疾病[10]。高良姜、大高良姜、红豆蔻有温胃止呕、散寒止痛的功效和抗胃溃疡的作用[11-13],黄酮类成分是高良姜、大高良姜、红豆蔻3味山姜属中药的主要成分之一。按中医的理论,胃溃疡属“嘈杂”“胃痞病”[14],主要病因在于阴寒之邪侵犯,脾胃失温,气血津液凝结、经脉阻滞,临床上表现为恶寒喜暖、大便稀溏、脘腹剧痛等[15]。有研究显示,冷应激性胃溃疡存在一定的性别差异[16]。本实验在中医胃溃疡的病因以及病机的指导下,根据课题组前期的研究,采用冰乙酸及冰知母溶液对雄性大鼠进行造模,同时通过营造外界寒冷因素的干扰,让大鼠在应激状态下使机体交感神经、内分泌功能失调产生急性胃溃疡[17],符合寒邪客胃型病理上的胃溃疡寒证特征[18],复制胃溃疡寒证模型。以3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠环核苷酸水平及交感神经-肾上腺轴ACTH、D-β-H的影响进行研究。

AC是细胞质膜内侧的一种水解酶,是cAMP信号通路的主要调控因子,可以催化ATP转化成cAMP[19]。当外界信号刺激或细胞内代谢条件发生变化,AC的表达随之发生变化,从而激活cAMP信号通路,调节机体生理过程[20]。PDE2可以同时催化cAMP和cGMP的水解,cAMP和cGMP作为细胞内的第二信使物质,在神经元细胞之间传递信息使其成为创伤后应激障碍相关治疗干预的重要靶点,环核苷酸系统指标是典型的中药寒热温凉药性判断指标[21]。本研究结果显示,高良姜、大高良姜、红豆蔻高低剂量组大鼠胃组织AC含量明显升高,PDE2含量明显降低,cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高,说明3味山姜属中药黄酮类可通过调节机体生理变化,从而调节环核苷酸系统。

交感神经与肾上腺髓质的结构、功能关系密切,故常合称为交感-肾上腺髓质系统。ACTH可以促进D-β-H分泌,可刺激肾上腺皮质分泌肾上腺皮质激素升高血压、增进抵抗力、医学上可用于抗炎症、抗过敏等[22]。有研究显示,通过穴位贴敷刺激大鼠交感神经可以有效缓解乙酸造成的大鼠胃溃疡黏膜损伤,促进溃疡愈合,改善胃平滑肌节律性收缩活动,从而减轻胃溃疡症状[23]。说明当机体处于应激状态时,下丘脑通过释放促肾上腺皮质激素释放激素,刺激ACTH的合成和分泌[24]。D-β-H蛋白响应刺激从含有儿茶酚胺的囊泡中释放D-β-H,从而催化多巴胺转化为去甲肾上腺素并从交感神经元释放到循环中,刺激肾上腺皮质分泌肾上腺皮质激素,进而产生抗胃溃疡作用[25]。本研究结果显示,各给药组血清ACTH、D-β-H含量均升高,说明3味山姜属中药黄酮类成分有升高ACTH、D-β-H含量,提高交感神经-肾上腺系统功能活动和抗胃溃疡的作用。

综上所述,高良姜、大高良姜、红豆蔻黄酮类成分能够调节胃溃疡寒证大鼠环核苷酸水平和促进交感神经-肾上腺轴功能活动。通过升高AC、cAMP、ACTH、D-β-H含量及cAMP/cGMP比值,降低PDE2含量,调节胃溃疡寒证大鼠环核苷酸水平从而促进交感神经-肾上腺轴功能活动,说明具有亲缘关系的3味山姜属中药的药性具有相似性,即温热药性,3味山姜属中药黄酮类成分为其体现温热药性的化学物质基础之一。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。