2 型糖尿病患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其剪接异构体的表达水平和临床意义

王嘉欣, 王珍琦, 张 萱

（1.吉林大学第二医院内分泌科，吉林 长春130041；2.吉林大学公共卫生学院 国家卫健委放射生物学重点实验室，吉林 长春130021；3.吉林大学第二医院科研部，吉林 长春130041）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是一种以胰岛素分泌不足导致高血糖为特征的严重而常见的慢性代谢紊乱性疾病，可导致各种代谢并发症，如心脑血管疾病、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）、肾病和神经病变等。国际糖尿病联合会 （International Diabetes Federation，IDF）［1］数据显示：2019 年全球糖尿病患病率约为9.3%（4.63 亿人），到2030 年将上升 至10.2% （5.78 亿 人），到2045 年 将 上 升 至10.9%（7.00 亿人）。

近年来，全基因组关联性研究（genome-wide association studies， GWAS）的最新进展已经成功揭示了一些与T2DM 遗传易感性相关的基因和突变位点。细胞周期蛋白依赖性激酶5 调节亚基相关蛋 白 1 类 似 物 1 （cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1，CDKAL1）基因是欧洲和亚洲人群中重复性最强的位点之一。目前已鉴定出CDKAL1 的5 个不同风险单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），均来自内含子：rs4712523［2］、rs6931514［3］、rs7756992［4］、rs10946398［5］和rs9465871［6］。携带CDKAL1 基因SNP 的个体患T2DM 的风险较未携带者增加2 倍［7］。

糖尿病微血管并发症与CDKAL1 基因有密切关联。 在T2DM 患者中发现了CDKAL1 基因（rs7756992、rs4712527 和rs10946398 位点） 与糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 之间的关联［8］，CDKAL1 基 因（rs10946398 和rs7756992 位点）与DR 有关［9-10］。LIU 等［9］发现：与无视网膜病变的糖尿病患者比较， DR 患者CDKAL1（rs10946398） 的遗传变异有显著差异。上述研究表明： CDKAL1 可能在糖尿病相关并发症的发病中起关键作用。CDKAL1 基因与T2DM 及其并发症的关系多集中于SNP 位点上，而关于T2DM 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平与糖尿病微血管并发症关系的研究较少。本研究采用实时 荧 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法探讨T2DM 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其2 种mRNA剪接异构体CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表达水平，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020 年1 月—2021 年3 月在吉林大学第二医院内分泌科住院的65 例糖尿病患者作为研究对象，患者平均年龄为（45.45±7.49） 岁， 其 中T2DM 无 并 发 症 患 者20 例（T2DM 组），DN 患 者23 例（DN 组），DR 患 者22 例（DR 组），并选择同期在吉林大学第二医院28 名体检正常者作为健康对照组，平均年龄为（45.70±9.67） 岁。分组标准：T2DM 无并发症组，患者无并发症史，如DN、DR 和糖尿病周围神经病变等；DN 组，根据尿微量白蛋白与尿肌酐的比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR） 连续2 次或者2 次以上≥30 mg·g－1的T2DM 患者被诊断为DN，并且通过相关临床检查排除其他肾脏疾病；DR 组，符合《眼科学》中关于2 型糖尿病视网膜病变（type 2 diabetic retinopathy，T2DR） 的诊断标准，且经眼底和荧光素眼底血管造影检查确诊为 T2DR；健康对照组：身体健康，无糖尿病家族史，空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）<7.0 mmol·L－1，糖化血红蛋白<6.5%，无特殊用药史，来源于本院体检中心的健康体检者，均签署知情同意书。各组研究对象年龄和性别比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入和排除标准纳入标准：T2DM 诊断标准参照1999 年WHO 糖尿病诊断标准，存在糖尿病症状且随机血浆葡萄糖≥11.1 mmol·L－1或FBG≥7.0 mmol·L－1，或口服葡萄糖耐量试验2 h 血糖≥11.1 mmol·L－1。排除标准：糖尿病急性并发症，如糖尿病酮症和高渗性昏迷等；高血压；重度肥胖；原发性肾病；泌尿系异常、急（慢）性肾炎或肾盂肾炎或尿路感染等引起的蛋白尿和其他肾损害；严重心肺及肝脏病变；发热；活动后、应激和情绪激动者；曾使用肾毒性或影响尿蛋白排泄的药物和服用过影响血脂、凝血功能及血尿酸代谢的药物。

1.3 细胞分离和处理上述糖尿病患者和健康对照者均知情同意后，采集其EDTA 抗凝静脉血5 mL，抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，提取总RNA， 采用焦碳酸二乙酯 （diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理的无菌EP管于－80 ℃条件下保存待检测。

1.4 RT-qPCR 法检测各组研究对象外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平按照红细胞裂解液说明书裂解红细胞，按照TRIzol 试剂说明书提取总RNA。RNA 浓度和纯度检测：A（260）/A（280）比值为1.8～2.0，以3 μg RNA 为模板，按照逆转录试剂盒操作程序进行逆转录合成cDNA。CDKAL1 基因表达及其可变剪切异构体及GAPHD引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。采用美国Agilent Technologies 公司的RT-qPCR 试 剂 盒（Brilliant ⅡSYBR Green qPCR Master Mix）进行RT-qPCR 反应。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

总反应体系为25 μL： 2× SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，Primer mix（上下游引物均为10 mmol·L－1）1 μL，ROX Reference dye 0.375 μL，ddH2O 10.125 μL， cDNA 1 μL。 采 用 美 国Stratagene MX3000P 荧 光 定 量PCR 仪， 采 用Comparative Quantitation 方法进行PCR 扩增，RTqPCR 反应条件：预变性95 ℃、30 s，95 ℃、20 s，60 ℃、35 s，共45 个循环；熔解曲线测定95 ℃、1 min ，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s， 1 个循环。以GAPDH 基 因 为 内 参 基 因， 采 用2－ΔΔCt法 计 算CDKAL1 基因表达水平。

1.5 统计学分析采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。各组研究对象外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其2 种剪接异构体CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表达水平均不符合正态分布，以中位数和四分位数［M （P25，P75）］ 表示，多组间样本比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

RT-qPCR 法检测各组研究对象外周血淋巴细胞中CDKAL1、CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表达水平，以GAPDH 为内参。CDKAL1、CDKAL1-X1、CDKAL1-X2 和GAPDH 在T2DM 患者外周 血中均有表达。与健康对照组比较，T2DM 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平升高（Z=4.705，P<0.01），DN 组 和DR 组 患 者 外 周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平均升高（Z=－3.199，P=0.001；Z=－4.950，P<0.01）。与健康对照组比较，T2DM 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1-X1 表达水平升高（Z=2.698，P=0.007），DN 组和DR 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1-X1 表达水平升高（Z=－2.508，P=0.012；Z=－2.814，P=0.005），T2DM 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1-X2 表达水平差异均 无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组研究对象外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其可变剪切异构体表达水平Tab.2 Expression levels of CDKAL1 and its splice isomers of subjects in various groups [M(P25,P75)]

与T2DM 组比较，DN 组和DR 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其可变剪切异构体表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；DR 组患者外周血淋巴细胞中 CDKAL1 基因表达水平略高于DN 组（P<0.05），CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

本研究结果显示：与健康对照组比较，T2DM组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表达水平升高，而 CDKAL1-X2 表达水平差异无统计学意义；DN 组和DR 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达和CDKAL1-X1表达水平升高，提示其参与糖尿病及其并发症的发生发展。

CDKAL1 基因位于染色体6p22.3 上，全长为697 948 bp。CDKAL1 基因异常引起胰岛素分泌减少［11-12］，在β 细胞功能障碍和易感性的病理生理学中起关键作用［13-14］。因此，CDKAL1 基因被多项研究［15-18］证实为T2DM 的易感基因，目前已发现CDKAL1 基因的SNPs 位点1.6 万个，与T2DM 相关的SNPs 位于深层内含子区域，因此在中国人群中CDKAL1 基 因 的SNPs 存 在 不 确 定 性［19］。本 文作者发现：T2DM 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表达水平较健康对照组升高，提示CDKAL-X1 在T2DM 中发挥主要作用。既往国内对于T2DM 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达研究较少，研究［20］显示：在DN 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平升高，而国内至今尚无关于CDKAL1 剪接异构体的表达水平的研究。ZHOU 等［21］研究发现一种独特的CDKAL1 特殊剪接变异，称为CDKAL1-V1，其可下调细胞中CDKAL1 基因表达及蛋白翻译水平，且这种特殊剪接变异体周围聚集大量与T2DM发病相关的SNPs。HOSSEINIPOOR 等［22］检测到T2DM 患者外周血单个核细胞中晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）和核转录因子NF-E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）基因表达水平升高，但未检测出CDKAL1 基因。

本研究结果显示：T2DM 患者并发DN 和DR时，CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表达水平升高。与DN 组比较，DR 组患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平升高更明显。研究［20］显示：DN 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因表达水平升高，与本研究结论一致。SHATAF 等［23］研究7 个T2DM 易感基因表达，结果显示：WFS1 和NOTCH2 基因表达改变可能在DN 发生发展中起作用。本研究结果显示：T2DM 微血管并发症患者中，T2DM 易感基因CDKAL1 及其剪接异构体表达发生变化。由于血浆样本较易得，以其为样本的基因表达研究更多是采用RT-qPCR 法寻找潜在生物标志物，探讨T2DM 发生发展的机制，但这些机制目前尚不十分明确。血液指标可以反映患者全身代谢情况的变化，但是难以反映肾脏和眼局部病变的代谢情况，且个体差异较大，导致结果重复性差，仍需更多的研究来验证这些结论。本研究局限性：尚未讨论基因表达与糖尿病患者临床检验指标的关系；研究的样本量较少，有待进一步开展大样本的研究。

本研究针对T2DM 患者外周血淋巴细胞中易感基因CDKAL1 表达及其剪接异构体进行初步研究，结果显示：T2DM 患者外周血淋巴细胞中CDKAL1 基因及其剪接异构体CDKAL1-X1 的表达水平较健康对照者升高，证明T2DM 及其并发症患者外周血淋巴细胞中易感基因及其剪接异构体表达水平不同，本研究结论可为深入了解T2DM 的发病机制提供依据。