MiR-491-5p 过表达对人鼻咽癌HONE-1 细胞增殖和迁移的影响

王丹丹, 周 宁, 刘冬芹, 赵 杰, 梁 超, 代娟娟, 武 艳

（1.滨州医学院附属医院肿瘤科，山东 滨州 256600；2.滨州医学院附属医院医学研究中心，山东滨州 256600；3.滨州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，山东 滨州 256600；4.山东省滨州市人民医院消化内科，山东 滨州 256600）

鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，占所有头颈部恶性肿瘤的50%；其具有独特的地理分布特征，主要分布于我国南方和东南亚地区［1］。目前，鼻咽癌的治疗方法主要有放疗和化疗。尽管在治疗策略上取得了突破，但诊断不及时和耐药可导致鼻咽癌患者的临床结果不满意［2-3］。因此，阐明鼻咽癌的发生发展机制对探讨鼻咽癌新的治疗方法有重要意义。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类短小的单链非编码RNAs，由22～25 个核苷酸组成，通过直接与靶mRNAs 的3'-非翻译区（3'-UTR）结合来抑制蛋白质翻译，从而使mRNA降解或翻译抑制。miRNAs 参与调控各种基本的生物过程，如细胞发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋 亡、细 胞 侵 袭 和 代 谢［1，4-5］。微 小RNA-491-5p（microRNA-491-5p，miR-491-5p） 是 一 种 保 守 的miRNA，参与调节炎症反应、脂肪生成和细胞增殖等生理过程。研究［6］显示：miR-491-5p 在实体肿瘤，特别是生殖系统和消化系统肿瘤中发挥重要的调节作用。然而，miR-491-5p 在鼻咽癌发生发展中的作用机制尚不明确。本研究探讨过表达miR-491-5p 对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响，为鼻咽癌的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒、主要试剂和仪器人鼻咽癌HONE-1 细胞为本实验室保存。对照质粒和miR-491-5p 质粒均为本实验室保存。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 购于江苏依科赛生物科技股份有限公司，DMEM 培养基和胰蛋白酶均购于美国BI 公司，MEM 培养基购于北京中科迈晨科技有限公司，LipofectamineTM3000 试剂盒购于美国Invitrogen 公司，TRIzol 试剂和逆转录试剂购于美国Thermo 公司，反转录试剂盒购于美国Thermo Fisher 公司。Flag 抗体、Tubulin 抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG 抗体购于美国Proteintech 公司，波形蛋白和上皮钙黏素抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 购于江苏近岸蛋白质科技有限公司，CCK-8 试剂购于大连美仑生物技术有限公司。荧光显微镜购于日本Olympus 公司，CO2培养箱购于美国Thermo Fisher 公司，酶标仪购于美国Bio-Tek 公司。

1.2 人鼻咽癌HONE-1 细胞培养和质粒转染鼻咽癌HONE-1 细胞采用含10%FBS 和1% 双抗的DMEM 培养基培养，培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度。当培养皿中细胞生长至约90%密度后，采用0.25%胰酶消化传代。

将HONE1 细胞置于6 孔细胞培养板中，当细胞 密 度 达 到 约70% 时 开 始 转 染。 将3 μL LipofectamineTM3000 加入至25 μL MEM 培养基中，然后将其加入至含3 μL P3000 和1.5 μg 质粒（对照 组） 或miR-491-5p 质 粒（miR-491-5p 组） 的MEM 培养基中，室温下共孵育15 min，分别加入至对应的6 孔细胞培养板中，继续培养48 h。48 h后采用荧光显微镜观察质粒的转染效率，转染效率=绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。

1.3 CCK-8 法检测2 组HONE-1 细胞增殖活性

将转染后的细胞以每孔1×103个的密度接种至96 孔细胞培养板中，每组设置3 个复孔。细胞贴壁后设置为0 h，每孔加入5 μL CCK-8 试剂后继续培养2 h，采用酶标仪于450 nm 处检测2 组细胞吸光度（A）值，以A 值代表细胞增殖活性。在24、48和72 h 分别重复上述操作。以0 h 时平均A 值进行归一化处理后（将0 h 时平均A 值设为1），以归一化处理后的A 值代表细胞增殖活性， 采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析并绘图。实验至少重复3 次。

1.4 Transwell 小室实验检测2 组HONE-1 细胞迁移数收集2 组HONE-1 细胞， 采用无血清DMEM 培养基稀释至细胞密度为3×104mL－1，将稀释后的细胞混匀后，吸取100 μL 细胞悬液加入至Transwell 小室的上室，于Transwell 小室的下室中 加入800 μL 含20% FBS 的DMEM 培养基，继续培养72 h。采用镊子取出小室后采用棉签轻轻吸净小室内液体，结晶紫染色1 min 后采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗，去除多余结晶紫，于显微镜下拍照计数，统计迁移细胞数，该实验重复3 次，取平均值，并采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行统计学分析并绘图。

1.5 实时荧光定量PCR（ real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测HONE-1 细胞中波形蛋白和上皮钙黏素mRNA 表达水平收集2 组细胞，分别加入500 μL TRIzol 试剂，室温下充分裂解后加入100 μL 氯仿，4 ℃、12 000 r·min－1离心10 min，吸取上清于新管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀， 室温下静置10 min， 4 ℃、12 000 r·min－1离 心10 min，弃 上 清，加 入1 mL 75%乙醇，相同条件再次离心，弃上清，室温干燥10 min，加入无核酸酶水溶解RNA，采用反转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，并检测其浓度和完 整 性。 采 用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 进行PCR 验证。引物序列：E-cadherin正向引物 5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'， E-cadherin 反向引物5'-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；Vimentin正向引物5'-CGCCAACTACATCGACAAGGTGC-3'， Vimentin反向引物5'-CTGGTCCACCTGCCGGCGCAG-3'；GAPDH 正向引物5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'，GAPDH 反向引物5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'；反应条件：95 ℃、15 s，53 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35 个循环。实验重复3 次，以GAPDH 为内参，采用2－ΔΔCt法计算相关基因mRNA 表达水平。

1.6 Western blotting 法检测HONE-1 细胞中波形蛋白和上皮钙黏素蛋白表达水平收集2 组细胞，采用RIPA 细胞裂解液提取总蛋白。采用湿转方式将蛋白从10% SDS-PAGE 凝胶电泳转移至PVDF膜上。采用5%脱脂牛奶室温下摇床封闭1 h，分别采用抗波形蛋白抗体（1∶2 000）、抗上皮钙黏素抗体（1∶1 000）和抗GAPDH 抗体（1∶3 000）于4 ℃摇床上孵育过夜。次日TBST 清洗3 次，置入稀释好的HRP 标记的羊抗兔或羊抗鼠抗体（1∶2 000）中，室温下摇床孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次。采用极敏感增强型化学发光试剂（enhanced chemilumin escence，ECL）试剂盒进行曝光成像，以 GAPDH 作为内参蛋白，采用Image J 软件进行灰度值分析，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带 灰度值/GAPDH 条带灰度值。实验重复3 次。

1.7 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk 检验对各组数据进行正态性检验，过表达miR-491-5p 后2 组细胞增殖活性、迁移细胞数和细胞中波形蛋白及上皮钙黏素mRNA 和蛋白表达水平均符合正态分布，以±s表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2 组HONE-1 细胞中质粒转染效率在荧光显微镜下观察HONE1 细胞转染相应质粒72 h 后，对照组和miR-491-5p 组质粒转染效率均>70%，可初步判定转染成功。见图1。

图1 荧光显微镜观察2 组细胞转染效率（Bar=100 μm）Fig.1 Transfection rates of cells in two groups detected by fluorescence microscope（Bar=100 μm）

2.2 2 组细胞增殖活性作用24、48 和72 h 时，与对照组比较， miR-491-5p 组HONE-1 细胞增殖活性明显降低（P<0.05 或P<0.01）。见图2。

图2 CCK-8 法检测2 组HONE-1 细胞增殖活性Fig.2 Proliferation activities of HONE-1 cells in two groups detected by CCK-8 method

2.3 2 组HONE-1 细胞的迁移细胞数Transwell小室实验结果显示：与对照组（110 个±10 个）比较，miR-491-5p 组 侵袭细胞数（44 个±9 个） 明显减少（t=9.639，P<0.01）。见图3。

图3 Transwell 小室实验检测2 组HONE-1 细胞迁移情况（结晶紫，×400）Fig.3 Migration of HONE-1 cells in two groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet, ×400)

2.4 2 组HONE-1 细胞中波形蛋白和上皮钙黏素mRNA 表达水平与对照组比较， miR-491-5p 组HONE1 细胞中波形蛋白mRNA 表达水平明显降低（t=7.535，P=0.001 7），上皮钙黏素mRNA 表达水平明显升高（t=4.880，P=0.039 5）。见图4。

图4 RT-qPCR法检测2组HONE1细胞中波形蛋白（A）和上皮钙黏素（B） mRNA 表达水平Fig.4 Expression levels of Vimentin （A） and E-cadherin（B） mRNA in HONE-1 cells in two groups detected by RT-qPCR method

2.5 2 组HONE-1 细胞中波形蛋白和上皮钙黏素蛋白表达水平Western blotting 法检测结果显示：miR-491-5p 组HONE-1 细胞中波形蛋白表达水平明显低于对照组（t=7.219，P＝0.018 7）；上皮钙黏素蛋白表达水平明显高于对照组（t=5.754，P=0.028 9）。见图5。

图5 Western blotting 法检测2 组HONE1 细胞中波形蛋白和上皮钙黏素蛋白表达情况Fig.5 Expressions of Vimentin and E-cadherin proteins in HONE-1 cells in two groups detected by Western blotting method

3 讨 论

在鼻咽癌中存在多种异常表达的miRNAs，如在鼻咽癌细胞中miR-663 通过靶向结合细胞周期抑制因子CDKN1A，抑制其表达水平，促进鼻咽癌细胞的增殖和肿瘤的发生［7］。在鼻咽癌组织中miR-125b 表达升高，促进鼻咽癌细胞增殖，抑制其 凋 亡［8］。miR-9 可 以 直 接 靶 向C-X-C 基 序 趋 化 因子 受 体4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4），从而抑制鼻咽癌的发生［9］。上述研究结果显示miRNAs 在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用。本研究结果显示：过表达miR-491-5p 抑制鼻咽癌细胞增殖和迁移，因此miR-491-5p 有望成为治疗鼻咽癌的新靶点。

miR-491-5p 在不同的人类肿瘤中具有多效性，近年来，miR-491-5p 在各类癌症中的作用机制得到广 泛 关 注。在 食 管 鳞 癌［10］、胃 癌［11］、肝 细 胞癌［12］、结 直 肠 癌［13］和 乳 腺 癌［14］组 织 中，miR-491-5p 通过靶向特定的mRNA 发挥肿瘤抑制作用；而在肺腺癌［15］、急性淋巴细胞白血病［16］和急性髓系白血病［17］中，miR-491-5p 促进肿瘤的发生发展。目前miR-491-5p 在鼻咽癌中的作用及其机制尚不明确，因此深入探讨miR-491-5p 在鼻咽癌中的作用机制较重要。本研究结果显示：与对照组比较，过表达miR-491-5p 组鼻咽癌细胞的增殖能力和迁移能力降低，表明miR-491-5p 在鼻咽癌细胞中发挥抑癌基因的作用。

上 皮-间 质 转 化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT） 是指在一定的生理或病理情况下，上皮细胞通过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物学过程。这是一种可逆的细胞过程，EMT 将上皮细胞暂时置于准间充质细胞状态［18-20］。正常情况下，在人体不同组织中的上皮细胞具有极性，并通过紧密连接和黏附连接方式横向连接在一起，后者由细胞表面的E-钙黏素蛋白形成。当肿瘤发生时，EMT 被激活，E-钙黏素表达被抑制，导致典型上皮细胞形态丧失。细胞获得纺锤形的间质形态，并表达与间充质细胞状态相关的标记，特别是波形蛋白［21-23］。本研究结果显示：与对照组比较，过表达miR-491-5p 的HONE-1 细胞中波形蛋白mRNA 和蛋白表达水平明显降低，而上皮钙黏素mRNA 和蛋白表达水平明显升高，提示过表达miR-491-5p 对鼻咽癌细胞的EMT 有一定抑制作用。本研究存在一定局限性：①仅从细胞增殖、迁移和EMT 关键蛋白表达方面证明了miR-491-5p 对鼻咽癌细胞增殖及迁移的影响，未涉及miR-491-5p对鼻咽癌细胞抑制作用的具体调控机制；②仅从细胞水平探讨miR-491-5p 对鼻咽癌细胞的抑制作用，尚未涉及动物层面。本课题组后续将从上述2 个层面入手，深入剖析miR-491-5p 在鼻咽癌发生发展中的作用机制。

本研究通过在鼻咽癌HONE1 细胞中过表达miR-491-5p，验证了miR-491-5p 表达上调可以抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和EMT，表明miR-491-5p可能是鼻咽癌治疗的潜在靶点，为鼻咽癌发病机制和治疗方式研究提供依据。