二甲双胍对Ⅰ型成骨不全小鼠间充质干细胞成骨分化的影响及疗效探讨

王娟　赵玉霞　茹雅维　汪子涵　付婷　李光

摘要：目的 研究二甲双胍对Ⅰ型成骨不全小鼠（oim）脂肪间充质干细胞（oimADSCs）向成骨细胞分化的影响并初步探讨二甲双胍在oim中的治疗效果。方法 从oim中分离培养oimADSCs，通过观察细胞形态，碱性磷酸酶（ALP）染色和油红O染色对其分化能力进行鉴定；将oimADSCs分组进行诱导培养，通过观察ALP染色、检测ALP活性和实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测几种成骨分化相关分子的表达情况，分析二甲双胍对oimADSCs向成骨细胞分化的影响；利用微计算机断层扫描技术（Micro-CT）分析股骨的骨骼微观结构，观察二甲双胍在oim模型小鼠中的治疗效果。结果 在二甲双胍处理oimADSCs后，ALP染色显著加深、ALP活性显著提高，骨钙素（Bglap）、Ⅰ型膠原（Col1a1）、Runt相关转录因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的mRNA表达水平升高；Micro-CT分析发现oim模型小鼠经过二甲双胍治疗后，股骨骨小梁的骨体积/总体积增加，股骨骨小梁数目增多、厚度增加。结论 二甲双胍能够促进oimADSCs向成骨细胞分化，改善oim的骨骼生长情况。

关键词：成骨不全；间质干细胞；二甲双胍；Ⅰ型成骨不全；脂肪间充质干细胞；成骨分化

中图分类号：R681.1文献标志码：ADOI：10.11958/20221341

Study of effects of metformin on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone tissue regeneration in type I osteogenesis imperfecta mice

WANG Juan， ZHAO Yuxia， RU Yawei， WANG Zihan， FU Ting， LI Guang

Department of Genetics， School of Basic Medicine， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China

Corresponding Author E-mail： lig@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To evaluate the effect of metformin on the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells of type I osteogenesis imperfecta mice （oimADSCs）， and the therapeutic effect of metformin on bone tissue regeneration in oim mice. Methods The oimADSCs were isolated and cultured. Cell morphology observation， alkaline phosphatase staining and oil red O staining were used to validate the multiple differentiation potential of oimADSCs．After osteogenic induction，ALP staining and ALP activity were compared between groups. qPCR was applied to analyze the expression of osteogenic differentiation associated genes. Micro-CT was used to detect the femoral microstructure and analyze effects of metformin on bone regeneration in oim mice. Results Compared with the control group， ALP staining was more deeper and the ALP activity level was obviously increased in the osteogenesis+metformin group. The transcription levels of Bglap， Col1a1， Runx2 and BMP2 were significantly up-regulated. The micro-CT results revealed that after metformin treatment， BV/TV， trabecular number and Tb.Th of oim mice were increased. Conclusion Metformin can enhance osteogenic differentiation of oimADSCs in vitro and improve bone microstructure of oim mice in vivo．

Key words： osteogenesis imperfecta; mesenchymal stem cells; metformin; type I osteogenesis imperfecta; adipose derived mesenchymal stem cells; osteogenic differentiation

成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）是以反复骨折、骨质脆弱、骨畸形为临床特征的遗传性疾病［1-2］。Sillence等［3］将OI分为Ⅰ—Ⅳ型。Ⅰ型最常见的致病原因是编码Ⅰ型胶原蛋白α链的基因Col1a1突变，导致Ⅰ型胶原数量减少，进一步导致患者单位骨质的骨量下降和骨组织的代谢和（或）生长异常［4-5］。二甲双胍是临床治疗2型糖尿病的常用药。有研究发现其还具有骨保护作用［6］。糖尿病患者骨折率明显高于非糖尿病人群，长期服用二甲双胍可显著降低糖尿病患者的骨折发生率［7］；且骨质疏松症患者服用二甲双胍可以增加骨密度［8］。体内外研究发现二甲双胍不仅可以促进脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化，还可以促进成骨细胞的增殖、抑制破骨细胞的形成［9］。但是目前二甲双胍在OI患者或动物模型中的研究鲜见报道。本研究通过分离培养Ⅰ型OI小鼠（type Ⅰ osteogenesis imperfecta mice，oim）的脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells of oim mouse，oimADSCs），研究二甲双胍对oimADSCs向成骨细胞分化的影响，并初步探讨二甲双胍在oim中的治疗效果，以期为二甲双胍用于治疗Ⅰ型OI提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

oim由本实验室构建［10］：该小鼠品系为C57BL/6小鼠，该小鼠模型为通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Col1a1外显子2—5，构建而成的Col1a1缺失突变模型。本实验所用oim为8～9周龄，雄性，饲养于天津医科大学实验动物中心无特定病原体级别的屏障系统中。α-MEM培养基、链霉素、青霉素购自美国Hyclone公司，地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗坏血酸、吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤购自美国Sigma公司，Trizol试剂购自美国Thermo Scientific公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒购自德国Qiagen公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒、ALP活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Ⅰ型胶原酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司，组织基因组DNA提取试剂盒购自美国Biomiga公司。成骨诱导培养基具体成分如下：取100 μL地塞米松溶液（终浓度为1×10-7 mol/L）、10 mL β-磷酸甘油酯溶液（终浓度为1×10-5 mol/L）、2 mL抗坏血酸溶液（终浓度为100 mg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培养基至100 mL。成脂诱导培养基具体成分如下：取500 μL地塞米松溶液（终浓度为1×10-6 mol/L）、500 μL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（终浓度为5×10-4 mol/L）、100 μL吲哚美辛溶液（终浓度为1×10-6 mol/L）、142.86 μL胰岛素溶液（终浓度为5 μg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培养基至100 mL。

1.2 研究方法

1.2.1 oimADSCs的分离和培养

参照文献［11］，从oim中分离培养oimADSCs。颈椎脱臼法处死oim小鼠，在无菌环境中取出小鼠两侧腹股沟和附睾处脂肪组织，去除脂肪表面的结缔组织，将脂肪组织剪碎后加入Ⅰ型胶原酶，37 ℃恒温摇床消化45 min。加入胎牛血清终止消化，将细胞过滤离心后培养。用含15%胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，然后接种到细胞培养皿中，第3天更换半量培养基，第4天更换全部培养基，以后每2 d换1次培养基进行常规传代。

1.2.2 oimADSCs的成骨、成脂分化能力鉴定

选用P3代oimADSCs进行诱导分化。消化oimADSCs，制成细胞悬液并计数，按1×105个/孔接种到6孔板中。待细胞密度达到80%时，将细胞分组进行诱导培养，分为成骨对照组（加入α-MEM培养基）、成骨诱导组（加入成骨诱导培养基）、成脂对照组（加入α-MEM培养基）、成脂诱导组（加入成脂诱导培养基）。每组设置3个重复，每3 d更换1次新鲜培养基。对于成骨对照组、成骨诱导组在诱导14 d后固定细胞，随后进行ALP染色鉴定成骨分化能力；对于成脂对照组、成脂诱导组在诱导14 d后固定细胞，随后进行油红O染液染色鉴定成脂分化能力。

1.2.3 ALP染色及活性检测

接種oimADSCs细胞，将细胞分为成骨诱导组（加入成骨诱导培养基）和实验组（成骨诱导培养基+500 μmol/L二甲双胍）进行诱导培养。每组重复3次，每隔2 d更换相应的培养基。在诱导7 d后，分别收集各组细胞培养上清液，按照试剂盒说明书检测ALP活性。在诱导14 d后，按照ALP染色试剂盒说明书要求固定细胞，随后进行ALP染色，通过ALP染色判定细胞向成骨方向分化能力。

1.2.4 qPCR检测成骨相关因子

消化P3代oimADSCs，计数后以1×105个/孔接种到6孔板，将细胞分为成骨诱导组（加入成骨诱导培养基）和实验组（成骨诱导培养基+500 μmol/L二甲双胍）进行诱导培养。每隔2 d更换相应的培养基。14 d后收集细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，再用试剂盒反转录成cDNA，采用qPCR检测骨钙素（Bglap）、Ⅰ型胶原α链（Col1a1）、Runt相关转录因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的表达量，引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

1.2.5 动物实验分组

取oim 12只，随机分为二甲双胍组（2 mg·kg-1·d-1）和对照组（生理盐水），每组6只，治疗2个月，二甲双胍组每天灌胃含二甲双胍的生理盐水，对照组每天灌胃等体积的生理盐水。在治疗结束后，颈椎脱臼处死各组小鼠，分离股骨，并在4%多聚甲醛中固定3 d，用于检测股骨微观结构。

1.2.6 微计算机断层扫描（Micro-CT）检测股骨微观结构

应用Micro-CT分析仪（SkyScan 1276）对小鼠股骨进行扫描。扫描完成后用软件（CTAn，1.15.4）对股骨三维结构进行重建，并分析从生长板下缘至骨小梁消失处区域的微观结构参数。骨小梁参数包括骨体积/总体积（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 oimADSCs的成骨和成脂分化能力鉴定

随着成骨分化诱导的进行，细胞形态逐渐由梭形变为锥体形，沉淀增多并聚集凝结在一起形成钙结节；随着成脂分化诱导的进行，细胞形态逐渐由梭形变为圆形、椭圆形，从胞膜下脂肪小颗粒逐渐形成脂滴，见图1。ALP染色结果显示，oimADSCs在成骨分化诱导后ALP表达活性增高；油红O染色结果显示oimADSCs在成脂分化诱导后出现红色的脂滴，见图2。表明oimADSCs成骨分化、成脂分化诱导成功，分离得到的oimADSCs具有多向分化潜能，为典型的间充质干细胞。

2.2 二甲双胍对oimADSCs成骨分化的影响

与成骨诱导组相比，实验组的ALP染色加深、ALP活性升高［（2.91±0.28）U/L vs. （1.07±0.12）U/L，n=3，t=10.664，P＜0.01］。见图3。与成骨诱导组相比，实验组细胞中成骨分化相关因子BMP2、Runx2、Col1a1、Bglap的mRNA表达水平升高，见表2。

2.3 二甲雙胍对oim的治疗效果

Micro-CT结果显示，与对照组相比，二甲双胍组BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，见图4、表3。

3 讨论

3.1 OI的临床症状及治疗方法

OI患者的临床表现包括频繁骨折和骨折愈合不良，给患者带来极大的痛苦和经济负担。Ⅰ型OI是发病率最高的一种OI，最常见的致病原因是Col1a1突变，导致Ⅰ型胶原数量减少，从而导致骨基质量不足。本研究所用的oim经过Ⅰ型胶原水平、骨密度、骨量、力学性能及骨代谢等多方面检测，其表型符合oim特征［10］。OI是一种由于基因突变导致的遗传性疾病，目前尚无治愈的方法，当前主要是采用外科手术和药物联合等方法治疗［12-13］。虽然取得了一定的疗效，但不能从根本上解决患者干细胞分化能力缺陷、成骨细胞功能降低、Ⅰ型胶原合成不足等问题［14-15］。

3.2 二甲双胍对骨代谢的影响

作为治疗2型糖尿病的经典药物，二甲双胍具有价格低廉和疗效可靠的优点［16］。随着研究者对二甲双胍降糖以及降糖以外作用研究的不断深入，发现其具有促进组织再生的功能。在小鼠皮肤涂抹二甲双胍可以促进毛发生长，其通过腺苷酸活化蛋白激酶和mTOR信号通路激活自噬，促使毛囊从休止期进入生长期，从而促进毛发再生［17］。Neumann等［18］发现二甲双胍可以促进大鼠老化的少突胶质细胞祖细胞的分化功能，并进一步促进髓鞘再生。多项研究亦证实二甲双胍对骨代谢具有有益的作用，包括抑制成脂分化、减少破骨细胞数目、修复骨缺损等［19-20］。二甲双胍在Ⅰ型OI中是否具有促进骨组织再生的作用以及是否对骨代谢有益有待进一步研究。本研究利用Micro-CT分析发现，oim在经二甲双胍治疗后，股骨骨小梁的BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，说明在oim中二甲双胍能够显著改善股骨的微观结构。

3.3 二甲双胍对oimADSCs细胞成骨分化的影响

有研究发现，二甲双胍干预后MC3T3E1细胞和成骨细胞中Col1a1的mRNA表达水平显著增加［21-22］。本研究发现二甲双胍不仅能够促进oimADSCs向成骨细胞分化，还能促进Col1a1的表达。Ⅰ型胶原是由两条α1（Ⅰ）链和一条α2（Ⅰ）链构成的三股螺旋结构，占骨基质有机物的90%左右，是骨矿物质沉积的矿化支架；其中α1链是由基因Col1a1编码合成的，Col1a1的表达水平直接影响了Ⅰ型胶原的含量。在Ⅰ型OI中由于Ⅰ型胶原的含量减少导致机体成骨微环境被破坏，而二甲双胍可以促进Col1a1的表达，有望提高Ⅰ型胶原的含量并改善Ⅰ型OI患者的成骨微环境。

综上所述，本研究利用体外细胞实验表明二甲双胍具有促进oimADSCs细胞向成骨细胞分化以及促进Col1a1表达的能力，体内实验发现在经二甲双胍治疗后，oim的股骨的微观结构有很大程度改善。本实验为二甲双胍治疗Ⅰ型OI奠定了一定的理论基础和实验依据，为Ⅰ型OI患者的临床治疗提供了新的思路与方法。

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（2022-09-01收稿 2023-02-28修回）

（本文編辑 李鹏）