DNA甲基化修饰在眼科疾病发病进程中的作用研究进展

杨朝晖,刘金鹏,郭大东,毕宏生,3

0 引言

早在1944年Avery等[1-2]在研究肺炎球菌中存在的生物活性物质中就发现了DNA甲基化修饰,到20世纪80年代,研究证实DNA甲基化修饰参与了基因调控和细胞分化等重要的生命过程,人们逐渐意识到DNA甲基化修饰在生命发展过程中可能发挥重要作用。DNA甲基化修饰属于表观遗传修饰的范畴,表观遗传修饰是指在不改变DNA序列的前提下产生稳定可遗传的表型变化,并且随着环境的变化能够发生可逆性的改变[3-4]。随着研究的发展,近年来人们发现DNA甲基化修饰可能参与了多种眼病的发病进程,包括Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy,FECD)、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、近视、视网膜母细胞瘤和葡萄膜黑色素瘤等,这为寻找相关眼病的发病机制以及发现新的治疗靶点提供了思路,本文就DNA甲基化修饰在眼病中的作用作简要综述。

1 DNA甲基化修饰

DNA甲基化修饰是最早发现的表观遗传修饰方式之一,是指通过DNA甲基转移酶将S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甲基基团共价添加到CpG二核苷酸的胞嘧啶5’位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶(5mC)(图1)。DNA甲基化修饰是一种动态可逆的酶促反应过程,依赖DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmts)发挥作用。Dnmt1是维持型甲基转移酶,执行维持甲基化功能,即能够将DNA双链中仅有一条链甲基化的DNA完全甲基化,而Dnmt3a和Dnmt3b执行从头甲基化功能,是指不依赖已有的DNA甲基化链在非甲基化位点引入甲基,为未修饰的DNA建立新的甲基化模式。

图1 DNA甲基化修饰示意图。

DNA甲基化修饰常发生于CpG岛(CpG islands,CGIs),CGIs是富含CG序列的区域,通常存在于基因启动子中[5]。在正常细胞中,DNA甲基化修饰确保了基因表达的适当调节和稳定的基因沉默,一旦DNA甲基化修饰发生异常改变,就会引起疾病的发生。目前已证实,DNA甲基化修饰与多种眼科疾病密切相关,异常的DNA甲基化修饰可严重危害人类的眼健康。

2 DNA甲基化修饰异常和眼科疾病

2.1DNA甲基化修饰与角结膜疾病

2.1.1DNA甲基化修饰与FECD 角膜内皮细胞的稳态对于维持角膜透明度至关重要。FECD角膜内皮营养不良是一种双侧角膜内皮细胞功能障碍引发的角膜混浊和视力丧失的疾病,分为早发性FECD和迟发性FECD。研究表明,迟发性FECD的角膜内皮细胞中miR-199b启动子DNA高甲基化导致miR-199b-5p表达下调,使其调控的靶基因Snai1和ZEB1表达增加,证实miR-199b-5p可能作为预防或减缓FECD疾病进展的潜在治疗靶点[6]。Khuc等[7]发现,迟发性FECD中基因SLC4A11的启动子DNA高甲基化可导致SLC4A11基因沉默,进而影响离子运输功能,导致角膜内皮失代偿。因此,启动子区的DNA甲基化修饰异常可能与FECD有关。

2.1.2DNA甲基化修饰与其他角结膜疾病角膜是眼球生理结构的最外层,极易受到外界的刺激和伤害。角膜的碱性灼伤因为伴随着新生血管形成和纤维化成为眼睛最难处理的损伤之一。在角膜损伤小鼠模型中发现,Dnmt3b的表达升高导致mTOR启动子发生从头甲基化,使得mTOR表达下调,从而延缓角膜新生血管的生成[8],证实DNA甲基化修饰在PI3K/AKT/mTOR信号轴中发挥作用。而在角膜损伤修复过程中发现,角膜上皮创伤愈合期间Dnmt1和Dnmt3b表达显著上调可导致全基因组DNA甲基化,并通过靶向miR-200a和CDKN2B增强进角膜上皮伤口的愈合过程[9],为治疗角膜上皮伤口愈合提供新型潜在药物靶点。圆锥角膜是一种可能导致视力丧失的角膜疾病,受到遗传和环境因素的双重影响。Kabza等[10]对人类角膜组织进行DNA甲基化修饰测序发现圆锥角膜组织中12个下调基因和6个上调基因位于已确定的甲基化差异区域附近。进一步研究发现,分泌型糖蛋白WNT5A和WNT3的外显子区域高度DNA甲基化修饰引起了WNT5A下调、WNT3上调,说明DNA甲基化修饰能够通过多种不同机制影响WNT通路,参与调节角膜上皮干细胞的增殖功能。眼组织的瘢痕修复多与纤维化密切相关,在结膜上皮细胞中发现,miR-200位点启动子的DNA去甲基化对于延缓人结膜上皮细胞中的间充质转化至关重要[11]。上述研究表明,开发基于表观遗传学的新型治疗药物用于治疗与上皮细胞间充质转化相关的结膜疾病,具有重要价值和光明前景。

2.2DNA甲基化修饰与葡萄膜炎葡萄膜炎(uveitis)是常见的眼内炎症性疾病,严重者可导致视觉障碍甚至失明。我们前期研究发现,葡萄膜炎患者外周血中DNA去甲基化酶TET2的过度表达能够导致Notch1基因的低甲基化,促进初始CD4+T细胞分化为Th17亚群,从而影响葡萄膜炎患者Th17/Treg比例的平衡,表明Notch1基因的低甲基化与葡萄膜炎的发生密切相关[12]。另有研究证实,与活动性葡萄膜炎患者相比,临床症状缓解患者的外周血单核细胞在FOXP3启动子和TIGIT基因座的CpG位点的DNA甲基化修饰水平较低,通过体外功能研究证实临床缓解患者TIGIT的高表达,可有效抑制T细胞增殖,这为治疗复发性葡萄膜炎提供了治疗方向[13]。在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠视网膜中观察到Tbx21的两个CpG位点,和Rorc的一个CpG位点在EAU期间显示出显著的甲基化变化,进而影响Th1和Th17转录因子的表达并促进EAU的发展[14]。Zou等[15]在EAU大鼠模型中发现,DNA甲基化抑制剂zebularine可以靶向CD4+T细胞控制眼内炎症和视网膜损伤,提示zebularine有可能成为葡萄膜炎新候选治疗药物,但缺乏临床研究证据。

2.3DNA甲基化修饰与视网膜疾病

2.3.1DNA甲基化修饰与视网膜发育多项研究证实DNA甲基化修饰在许多动物的视网膜发育中发挥重要作用。在小鼠视网膜胚胎祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs)中,控制视杆和视锥光传导基因表达的启动子区域高度甲基化,然而在成熟的光感受器中,这些区域相对于RPC是未甲基化或低甲基化的,证实DNA去甲基化途径是视网膜中光感受器发育所必需[16]。此外也有研究表明,小鼠视网膜视杆光感受器的全基因组甲基化模式可能随着年龄的增长而变化,与年龄有关的DNA甲基化修饰的变化不是随机的,而是定位在特定区域[17]。综上所述,DNA甲基化修饰是暂时性的,TET酶将甲基转化为羟甲基胞嘧啶,随后转化为甲酰胞嘧啶和羧基胞嘧啶,然后通过碱基切除修复,促进基因的去甲基化。在雏鸡中发现TET3是DNA去甲基化和视网膜再生的重要因素,积极的DNA去甲基化能够消除表观遗传障碍从而再生视网膜[18],因此DNA甲基化修饰在视网膜发育过程中发挥基因表达调节剂的重要作用。

2.3.2DNA甲基化修饰与糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见的眼底病变,可导致视力的不可逆性损伤。研究发现,糖尿病患者的视网膜线粒体肿胀,线粒体融合蛋白MFN2启动子DNA甲基化修饰导致其表达下调,而Dnmt抑制剂能够维持糖尿病中的线粒体稳态,并可减轻糖尿病患者视网膜病变的发展[19]。半胱氨酸β合成酶(CBS)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的启动子DNA高甲基化可以干扰同型半胱氨酸的正常清除,进而导致同型半胱氨酸的循环水平升高,从而增加视网膜病变风险[20]。对人视网膜微血管内皮细胞ACBRI 181细胞中进行MeDIP-seq等测序后通过高血糖大鼠模型进行研究发现,叶酸对DR视网膜微血管细胞DNA甲基化修饰的调节具有重要影响[21],叶酸和维生素B12与维持同型半胱氨酸的代谢密切相关,因此补充叶酸和维生素B12可能延缓糖尿病患者视网膜病变的发病进程,降低DR的风险,但其治疗效果背后的DNA甲基化修饰机制仍需进一步探究。此外,Dnmt1在糖尿病大鼠的视网膜中表达升高,但引起丝氨酸消旋酶(serine racemase,SR)表达增加,表明正调节因子可能会超越糖尿病视网膜中甲基化的沉默效应,导致DR的发生[22]。因此,Dnmt抑制剂有可能成为治疗DR的有效方法,但其是否存在与癌症治疗药物类似的副作用,是否会影响视网膜的结构与功能,仍需进一步研究。

Rac1启动子中H3K9me3的增加有助于Dnmt1的活化,Dnmt1通过DNA甲基化-羟甲基化增加Rac1表达,使得Nox2表达升高,产生胞质活性氧损伤视网膜线粒体从而导致视网膜病变的发生[23]。肥胖/高脂血症能够进一步增强线粒体DNA(mtDNA)和Rac1启动子的表观遗传修饰,加速线粒体损伤,促进DR的发展。因此,保持良好生活方式也可能有利于调节糖尿病患者的表观遗传修饰从而延缓视网膜病变的进展[24],而对Rac1 DNA甲基化修饰的干预可能是DR的治疗手段。

在DR的发展过程中,视网膜线粒体的损伤可能是由于碱基错配增加引起的。Mishra等[25]发现DNA甲基化修饰和碱基错配之间呈正相关关系,通过调节DNA甲基化修饰水平可显著抑制碱基错配,并能阻止DR的发展。糖尿病患者在控制血糖后,视网膜病变也会继续进展,这种“代谢记忆”现象可能与DNA甲基化修饰和碱基错配之间的串扰有关。此外,研究发现应用DNA甲基化修饰抑制剂可以通过维持线粒体动力学和DNA稳定性来防止视网膜功能损伤[26]。综上所述,DNA甲基化修饰的相关检测指标有望成为诊断DR的新型标志物,而DNA甲基化修饰引起的基因表达水平的改变可能在不久的将来成为DR治疗的靶点。

2.3.3DNA甲基化修饰与色素性视网膜炎色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa,RP)是一种遗传性视网膜退行性疾病,可能与DNA甲基化修饰密切相关。研究发现,在视网膜胚胎祖细胞分化为光感受器的过程中,调节序列(例如启动子、增强子)去甲基化的减少会降低相应基因的活性,导致RP的发生[27]。因此,使用基因疗法对少数调节DNA去甲基化途径的基因进行上调,可以间接促进靶基因的表达,为治疗RP开辟新的途径。

2.3.4DNA甲基化修饰与年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)是一种临床常见的严重威胁视力的眼病,通过对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞进行全基因组DNA甲基化修饰分析发现,与对照组相比,早/中期ARMD患者的RPE细胞中SKI、GTF2H4和TNXB的DNA甲基化修饰导致其转录本的相对表达量显著降低,证实DNA甲基化修饰的变化可能会导致RPE的表观遗传功能障碍,驱动ARMD的发生[28]。此外,应用DNA甲基化修饰和转录组测序相结合的方式在ARMD患者和对照组RPE层中筛选出了4827个差异甲基化CpG和456个差异表达基因,进一步通过表观遗传分析确定SMAD2和NGFR可作为ARMD的潜在标志物,也是ARMD的潜在治疗靶点[29]。

2.4DNA甲基化修饰与眼肿瘤

2.4.1DNA甲基化修饰与葡萄膜黑色素瘤DNA甲基化修饰已被证实是癌症发生、发展和转移的重要表观遗传驱动因素,异常的DNA甲基化修饰已成为许多癌症诊断和预后特征之一。Hou等[30]对甲基化组和转录组进行全基因组整合分析,筛选出40个与葡萄膜黑色素瘤发生和进展相关的甲基化驱动预后基因,其中8个基因已被证实参与了葡萄膜黑色素瘤的进展,17个基因已经被报道与其他眼病相关。随后确定了由10个甲基化驱动的预后基因组成的甲基化驱动标志(methylation-driven signature,MeSig),揭示了甲基化水平与生存率的相关性。Yang等[31]研究发现,DLL3的甲基化水平与其表达水平呈正相关,DLL3的高水平表达显著延长了葡萄膜黑色素瘤患者的总生存期,证实其可作为一种新的葡萄膜黑色素瘤诊断标志物和治疗靶点应用于临床。

2.4.2DNA甲基化修饰与视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤,起源于视网膜中成熟的光感受器前体细胞。通过对公共甲基化数据存储库检索包含RB、正常视网膜和其他视网膜疾病的数据集进行全基因组甲基化分析,发现两个CpG位点均位于TFAP2A的下游2k bp处,证实TFAP2A的甲基化状态可能是诊断RB的一种有效手段[32]。Mao等[33]从GEO数据库中检索到59个被诊断为RB样本的基因表达阵列并将其分为高浸润亚组和低浸润亚组,发现高浸润亚组中存在全基因组DNA高甲基化模式,表明DNA甲基化修饰的改变可能在RB免疫细胞浸润中起关键作用,该发现为研究RB的分子机制和临床免疫治疗提供新的途径。最近一项研究发现,眼房水与RB的肿瘤组织中检测到相同的RB1启动子DNA高甲基化[34],提示即使仅通过检测眼房水中的游离细胞DNA(cell-free DNA)中RB1启动子的DNA甲基化修饰水平,也能够反映RB的真实情况,为临床RB的早期诊断提供了可能。

2.5DNA甲基化修饰与青光眼Burdon等[35]通过全基因组关联性研究发现,CDKN2B启动子的甲基化状态可能与正常眼压性青光眼女性患者相关。Asefa等[36]通过对原发性开角型青光眼患者进行联合SMR分析发现了27个原发性开角型青光眼的新DNA甲基化修饰位点,突出了表观遗传学在青光眼中的作用。假性剥脱综合征是继发性开角型青光眼的常见病因。赖氨酰氧化酶样蛋白1(LOXL1)的表达通过DNA甲基化修饰在假性剥脱综合征中发生改变,证实表观遗传变化的逆转是假性剥脱综合征的潜在治疗靶点[37]。房水循环障碍是导致青光眼的重要因素之一,靶向房水循环障碍是治疗青光眼的一种有效途径。Wan等[38]通过研究发现,生长分化因子7(GDF7)启动子的去甲基化能够促进GDF7基因的转录并导致GDF7表达增加,GDF7的表达水平增加促使小梁网纤维化,引起房水流出减少,从而使眼压升高。对青光眼患者的小梁网细胞进行DNA甲基化修饰分析,发现全基因组甲基化增加同时伴随着TGFβ1的表达增加,而使用TGFβ1处理正常小梁网细胞会导致Dnmt1表达增加,与青光眼患者小梁网细胞相似,进一步证明了DNA甲基化修饰在青光眼发展中的作用[39]。因此,DNA甲基化修饰可能为研究青光眼的表观遗传机制提供新的见解,并且可能成为一种创新的治疗手段。

2.6DNA甲基化修饰与白内障先天性白内障在视觉系统发育的敏感期会严重影响视觉信息质量,临床上约一半的双眼先天性白内障和几乎所有单眼先天性白内障都因无法明确其发病机制被诊断为特发性先天性白内障。Liu等[40]通过对先天性白内障患者和无白内障受试者外周血测序发现了大量差异化甲基化区域,证实核心基因的甲基化水平可能会干扰细胞骨架和细胞间连接的功能,引发白内障。在高度近视并发核性白内障的病例中通过Sequenom Mass ARRAY技术发现抗氧化基因GSTP1和TXNRD2启动子中的特定CpG区域高甲基化,导致其表达水平降低,使得氧化应激增加,导致白内障的发生[41]。以上研究结果提示,调控基因的DNA甲基化修饰水平可能为靶向治疗特殊类型的白内障提供新思路。

2.7DNA甲基化修饰与近视近视被认为是与遗传和环境密切相关的眼病。研究发现,长散布核元件-1(LINE-1)的甲基化水平在近视患者和形觉剥夺小鼠中明显升高,而多巴胺可以通过降低Dnmt1来下调LINE-1甲基化水平,证实近视可能与DNA甲基化修饰水平有关[42],而LINE-1可能是治疗近视的有效靶点。Seow等[43]对脐带组织进行全基因组DNA甲基化修饰分析发现在早发性近视儿童中有5个CpG位点低甲基化,推断其甲基化水平影响了相关基因的表达,与近视的发生密切相关。对18例高度近视儿童与正常受试者的全基因组甲基化水平研究发现PCDHA10的启动子区域存在低甲基化,推测特定CpG岛甲基化模式的改变可能与早发性高度近视有关,该研究结果为儿童确定高度近视的无创生物标志物提供了理论依据[44]。另有研究对18例4～12岁高度近视患者的血液样本进行全基因组甲基化分析,鉴定出1541个高甲基化CpG区[45],证实即使在家族遗传的情况下,环境因素和户外时间可能仍会影响遗传性近视相关基因的表达水平。对形觉剥夺近视豚鼠模型的巩膜进行DNA甲基化修饰分析发现,造模4wk后胰岛素样生长因子1(IGF-1)启动子低甲基化导致IGF-1转录水平提高,影响了基因的表达,说明DNA甲基化修饰可能参与了近视的发展[46],靶向DNA甲基转移酶可以为治疗近视提供新的干预手段。

3 结语

综上所述,DNA甲基化修饰是一种不涉及DNA序列改变的修饰方式,可通过调控基因的表达水平在眼病的发生发展中发挥作用。随着高通量测序技术的迅速发展,人们对DNA甲基化修饰的认识也越发深入。依据DNA甲基化修饰的不同甲基化位点及其水平变化分析其在眼病发生发展过程中的作用,对深刻阐释眼病发生发展的病理机制具有重要意义,同时,DNA甲基化修饰的相关生物学指标检测或将优于病理学诊断,为眼病的早期发现和精准治疗提供了新的思路。