丹酚酸B对视网膜静脉阻塞损伤大鼠模型视网膜的保护作用及对血管新生的影响

刘志强,李亚坤,白 玫,郭向东,梁春利

0 引言

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是一种严重的视网膜血管疾病,涉及血管生成和黄斑水肿等并发症,可导致视力减弱甚至失明[1]。玻璃体腔注射抗VEGF药物、皮质类固醇和激光疗法已被用于治疗继发于视网膜中央RVO和分支RVO的黄斑水肿[2-3],但治疗效果和应用具有局限性[4],仍有15%～40%患者视力无反应或仅部分反应[5],因此积极探索治疗效果显著且副作用小的其他药物具有重要意义。丹酚酸B是传统中药丹参的主要有效水溶性成分,具有抑制血管新生的作用[6],但关于其是否可通过影响血管生成发挥对RVO损伤的改善作用尚未见报道,故本研究拟构建RVO大鼠模型,并经丹酚酸B治疗,探讨丹酚酸B对RVO大鼠视网膜组织病理、功能和血管生成相关因子的表达影响,以期为RVO抗VEGF药物选择提供一定参考资料。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠35只,6～8周龄,体质量为200±20g,济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[SCXK(鲁)2019-0003]。经裂隙灯检查,所有大鼠均排除眼部疾患。在室温(23±3)℃,湿度40%～65%环境下普通饲养,12h光-暗交替,给予充足水和普通饲料,适应性饲养1wk。本研究经河北北方学院实验动物伦理学委员会审批。

1.1.2药品和主要试剂及仪器丹酚酸B(纯度≥98%)(YRD029)购自成都仪睿生物科技有限公司;孟加拉玫瑰红(纯度≥95%)(632-69-9)购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 α,HIF1α)(ab216842)、信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)(ab68153)、p-STAT3(ab267373)、VEGF(ab46154)抗体购自美国Abcam公司;YZ5T型裂隙灯显微镜购自苏州六六视觉科技股份有限公司;GYC1000眼底激光仪购自英国Optoprobe公司;Invitrogen iBright凝胶成像系统购自赛默飞世尔生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1造模和分组及给药随机选取10只SD大鼠作为对照组,剩余25只均利用孟加拉玫瑰红联合激光光动力法诱导RVO大鼠模型[7-8]：腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉大鼠,0.4%盐酸奥布卡因和1%丁卡因进行局部麻醉,复方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分扩瞳(为防止角膜表面干燥和视网膜视野受损,在实验过程中定期使用氯化钠9mg/mL滴眼),后经尾静脉注射0.25mL孟加拉玫瑰红(50mg/kg),3～5min后,大鼠左眼角膜上放置滴加氧氟沙星眼膏的盖玻片,采用波长532nm的眼底激光仪沿着视网膜分支静脉进行激光照射以缩小血管,照射点距离视神经乳头1.5～3.0视盘直径(papilla disc,PD),功率60mW,光斑60μm,时间0.4s,见激光处静脉变细约1PD后,调整功率为80mW,光斑100μm,时间0.5s至视网膜静脉血流中断,远端静脉扩张,即造模成功。对照组仅尾静脉注射生理盐水,不施以激光诱导。成模大鼠21只,随机剔除1只,剩余大鼠随机分为模型组和丹酚酸B组,每组各10只,避光12h后次日给药。其中丹酚酸B组大鼠腹腔注射丹酚酸B 50mg/(kg·d),对照组及模型组大鼠仅注射等量生理盐水,连续21d。

1.2.2荧光素眼底血管造影技术观察视网膜静脉结构给药前和给药21d后腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉大鼠,复方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分扩瞳,腹腔注射10%荧光素钠0.3mL,结膜颜色呈黄色变化后,利用F-10共焦激光扫描检眼镜进行荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)检查,观察眼底情况并拍照。

1.2.3视网膜电图评估视网膜功能给药21d后,各组大鼠暗适应12h,麻醉及散瞳操作方法同前,视网膜电图(electroretinogram,ERG)[9]中,记录电极为氯化银电极,固定在角膜中央,不锈钢电极针分别作为参考电极和接地电极分别放在颊部和尾根部,暗光ERG使用RET Iport系统进行,LED闪光强度为-0dB(3.00cds/m2),刺激频率为0.15Hz,绘图时间为150ms,记录a波和b波振幅(μV)。其中光刺激下,开始的一个负波为a波,后出现一个正波为b波;a波振幅指从基线到b波波谷谷底部的垂直距离;b波振幅指a波波谷到b波波峰的垂直距离。

1.2.4HE染色观察视网膜组织学变化给药21d后,腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉大鼠并施行安乐死,迅速摘除各组大鼠左眼球,镜下使用手术显微剪去除角膜和晶状体,取5只置于4℃含4%多聚甲醛的固定液中固定48h以上。根据静脉阻塞部位常规制备石蜡切片,苏木精染色5min,0.5%盐酸乙醇分化10s,伊红液复染30s,水洗后梯度乙醇脱水,二甲苯透明,晾干后中性树胶封片,镜下观察并利用Image pro plus软件测量视网膜总层(RTL)、内核层(inner nuclear layer,INL)和外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度。

1.2.5VEGFA免疫荧光染色评估血管生成石蜡切片常规脱蜡、脱水,于3% H2O2中孵育10min以阻断内源性过氧化物酶活性,磷酸盐缓冲盐水漂洗3次,1%牛血清白蛋白孵育1h以阻断非特异性抗体,后将切片与VEGFA抗体(1∶200稀释)在4℃下孵育过夜,磷酸盐缓冲盐水洗涤3次,与Cy3标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗(1∶200稀释)室温下孵育1h,漂洗3次后,DAPI染核5min,荧光倒置显微镜下观察并拍照记录。以相对于对照组的VEGFA荧光强度(%)评估血管生成情况。

1.2.6Westernblot检测视网膜组织中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表达给药21d后,取各组5只大鼠视网膜组织(液氮中保存备用),预冷RIPA裂解液匀浆裂解,4℃下高速离心后取上清,BCA法测定蛋白浓度,调整蛋白为统一浓度,加热变性蛋白。SDS-PAGE分离等量蛋白并湿转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶37℃封闭2h,一抗4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2h,ECL显影,凝胶成像系统曝光并成像。Image J软件分析条带灰度值,以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1丹酚酸B对RVO大鼠视网膜静脉的影响FFA显示,治疗前对照组大鼠视网膜荧光在血管内均分布均匀;而模型组大鼠视网膜光凝部位可见明显静脉阻塞,远端视网膜静脉扩张、迂曲并伴有出血,毛细血管灌注破坏,21d后部分血管荧光不完整,有效侧支循环丰富,但形状不规则,见有荧光渗漏;丹酚酸B组大鼠治疗前视网膜病变同模型组,而经过丹酚酸B治疗21d后视网膜静脉循环恢复,形状逐渐规则,血管侧支减少,见图1。

图1 给药前后大鼠视网膜静脉结构观察。

2.2丹酚酸B对RVO大鼠a波和b波振幅的影响与对照组比较,模型组和丹酚酸B组大鼠ERG a波和b波振幅降低(均P<0.05);与模型组比较,丹酚酸B大鼠ERG a波和b波振幅升高(均P<0.05),见图2,表1。

表1 各组大鼠a波和b波振幅比较

图2 各组大鼠ERG图像。

2.3丹酚酸B对RVO大鼠视网膜组织病理变化的影响HE染色结果显示,对照组大鼠视网膜组织结构完整、各层排列整齐、界限清晰,视网膜神经节细胞呈单层排列,未见明显病理学损伤;模型组大鼠可见明显视网膜神经节细胞减少,分层排列紊乱,部分细胞坏死溶解,存在空泡化,INL和ONL明显变薄;丹酚酸B组大鼠视网膜组织病理损伤相对于模型组有所改善。与对照组比较,模型组和丹酚酸B组大鼠RTL、INL和ONL厚度均降低(均P<0.05);与模型组比较,丹酚酸B组大鼠RTL、INL和ONL厚度均升高(均P<0.05),见图3,表2。

表2 各组大鼠视网膜RTL、INL和ONL厚度比较

2.4丹酚酸B对RVO大鼠视网膜血管新生的影响三组大鼠视网膜组织中VEGFA荧光强度比较差异有统计学意义(F=190.806,P<0.001)。与对照组(100±0)%比较,模型组(305.57±24.62)%和丹酚酸B组(172.93±15.74)%大鼠视网膜组织中VEGFA荧光强度增强(均P<0.05);与模型组比较,丹酚酸B组大鼠视网膜组织中VEGFA荧光强度减弱(P<0.05),见图4。

图4 各组大鼠视网膜组织中VEGFA荧光染色图。

2.5丹酚酸B对RVO大鼠视网膜HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表达的影响组间STAT3蛋白相对表达量无显著性变化(P>0.05);与对照组比较,模型组和丹酚酸B组大鼠视网膜组织中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相对表达量升高(均P<0.05);与模型组比较,丹酚酸B组大鼠视网膜组织中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相对表达量降低(均P<0.05),见图5,表3。

表3 各组大鼠视网膜组织中被检蛋白相对表达量比较

图5 各组大鼠视网膜组织中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白条带 A:对照组;B:模型组;C:丹酚酸B组。

3 讨论

视网膜需要大量氧气来维持其生理功能,RVO通常会引起血流量减少和毛细血管脱落,导致视网膜缺氧进而诱发VEGF表达上调,而VEGF可增加血管通透性并导致血-视网膜屏障破坏,在黄斑水肿和视网膜新生血管形成中发挥重要作用[10]。因此,靶向VEGF的药物被认为是一种有前途的治疗方法。目前,抗VEGF主要通过直接干预降低VEGFA表达,临床研究证实有效,然而,抗VEGF药物仍然不可避免地表现出一些潜在缺点[11],因此促进血流恢复同时降低VEGF表达,减弱血管通透性、抑制血管过度新生可作为RVO药物治疗策略的靶点。

丹酚酸B为丹参水溶性成分丹酚酸的有效单体之一,体外实验已证实有较强的抗氧化、抗血栓生成及心脑血管保护作用[12-13]。RVO模型旨在成功实现视网膜静脉闭塞,导致缺氧缺血性损伤、血视网膜屏障破裂、神经元死亡和视网膜水肿,本研究模型组大鼠视网膜光凝部位可见明显静脉阻塞,远端视网膜静脉扩张、迂曲并伴有出血,毛细血管灌注破坏,经过21d后可见部分血管荧光不完整,有效侧支循环丰富,但形状不规则,见有荧光渗漏。相关临床研究同样表明视网膜分支静脉阻塞患者脉络膜血管指数升高,而抗VEGF治疗可减小脉络膜血管指数[14]。分析本研究中模型组大鼠视网膜病变可能是由于光凝造成血流阻断,血管压力升高,使得血管破裂,阻塞位置出现荧光渗漏,而阻塞部位远端血液充盈不足,使得大量毛细血管新生。此外,激光光凝对视网膜光凝区产生热效应、光化学效应和器质性损伤,对细胞内蛋白质结构造成一定程度的破坏,从而使毛细血管的管壁通透性升高,血管内容物渗出,导致视网膜缺血缺氧,诱导大量毛细血管新生,建立起丰富的毛细血管侧支网络[15-16]。丹酚酸B组大鼠治疗前视网膜病变同模型组,而经过21d丹酚酸B治疗后视网膜静脉循环恢复,形状逐渐规则,血管侧支减少,可能是由于丹酚酸B具有一定的溶栓作用,通过促进眼底视网膜阻塞血管再通减轻血管阻塞引起的病变[17-18]。

ERG是视网膜对光刺激的电反应,其组成部分a波、b波和振荡电位的振幅和时间模式取决于视网膜的功能完整性、到达视网膜的测试闪光强度和环境照明,其中a波测量视网膜感光器响应,b波是较为敏感的视网膜缺血指标,可反映视网膜INL细胞的电活动,均可用于评估视网膜功能[19]。研究发现,a波、b波振幅降低提示视网膜功能障碍[20]。ONL由感光视锥细胞和视杆细胞组成,INL有助于光信号转导,ONL感光细胞丢失可用于评估视网膜功能和视网膜敏感性[21]。本研究结果显示,与对照组比较,模型组大鼠ERG a波和b波振幅均下降,同时INL和ONL厚度均降低,提示视网膜功能障碍;经丹酚酸B治疗后,模型大鼠ERG a波和b波振幅均升高,结合大鼠视网膜组织学变化结果,提示丹酚酸B可能通过促进血流恢复,减轻大鼠视网膜缺血缺氧性病理损伤进而改善视网膜功能。

HIF-1α是对氧变化最敏感的转录因子,在缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞血管生成中起重要作用。当机体缺氧时,HIF-1α与HIF-1β结合形成化合物,可激活下游靶基因,调节一系列血管活性因子和细胞因子的基因表达和蛋白质合成[22]。据报道,HIF-1α可通过激活STAT3分子促进病理性新生血管形成,STAT3分子进一步调节其下游基因,包括VEGF[23]。而VEGF过表达是视网膜新生血管形成和血管渗漏的主要原因,可加重视网膜病理损伤及视觉障碍[24]。Yu等[25]基于化学计量学方法和谱效关系研究补肾活血方治疗糖尿病视网膜病变的Q标志物,发现丹酚酸B可显著抑制VEGF和HIF-1α表达。本研究经VEGFA免疫荧光染色和Western blotting法检测,发现模型组大鼠视网膜组织中VEGFA、HIF-1α和p-STAT3蛋白相对表达量均升高,而经丹酚酸B作用后,三者蛋白表达均下调,结合上述实验结果,提示丹酚酸B可能通过促进RVO大鼠静脉阻塞血流恢复,减轻视网膜组织缺氧性损伤,抑制HIF-1α/STAT3/VEGF信号通路激活,降低VEGFA表达进而减少病理性新生血管形成,改善视网膜功能。本研究结果与许琳等[26]研究报道的叔丁基对苯二酚通过下调HIF-1α和VEGF蛋白表达,可抑制糖尿病视网膜病变大鼠视网膜血管新生具有一致性。

综上所述,丹酚酸B可减轻RVO大鼠视网膜组织病理学损伤,改善视网膜功能,这可能与抑制HIF-1α/STAT3/VEGFA途径激活,减少血管新生有关。