油松体细胞胚胎发生技术研究进展

庞家举

（国有新宾满族自治县赵家林场，辽宁 新宾 113200）

油松Pinus tabulaeformis隶属松科松属，是我国的特有树种，又叫中国松，广泛分布于我国东北、华北以及西北地区。油松是我国重要的造林及用材树种，并且对恶劣环境适应能力强，耐干旱瘠薄，具有重要的生态价值。油松主要采用种子繁殖方式进行造林，这导致繁殖周期长，苗木分化程度大，林相不整齐，影响了造林质量，因此可以采用无性繁殖方式进行油松造林[1]。然而油松无性繁殖困难，对于选育的优良无性系难以规模化繁殖，所以不能使用传统的无性繁殖方式。植物体细胞胚胎发生技术是一种新兴的无性繁殖方式，指植物组织器官经过体外培养形成具有双极性胚性结构的过程，具有繁殖速度快、数量多、优良性状稳定遗传等优点。已有研究表明，针叶树种的体胚发生一般经历4 个阶段，首先是胚性愈伤组织的诱导，其次是胚性愈伤组织的保持与增殖，再次是体细胞胚的成熟，最后是体胚萌发及植株的再生[2]。本文概述了油松体细胞胚胎发生技术的研究进展，为后续的研究提供便利，使体胚发生技术成为油松大规模克隆繁殖的手段。

1 油松胚性愈伤组织的诱导

胚性愈伤组织的诱导是体胚发生的初始步骤，也是整个过程的限速步骤，能否诱导成功取决于外植体的种类、消毒方式、培养基的类型以及植物生长调节剂种类等。

1.1 外植体种类及消毒

目前，在油松体胚发生过程中应用最多的外植体包括油松成熟合子胚以及未成熟合子胚。当以成熟合子胚为外植体时，诱导出的大多数是不定芽或非胚性愈伤组织[3-5]，难以获得胚性愈伤组织。而以未成熟合子胚为外植体时，可以诱导出胚性愈伤组织，且诱导率较高。马丽源等[6]发现在7 月10 日左右采集的油松未成熟合子胚中，胚性愈伤组织的诱导率最高，可达88.3%。因此相对于成熟合子胚来说，最好选用未成熟合子胚作为油松体胚发生的外植体。

确定好外植体后要对其进行消毒，在油松种子采集后先用流水冲洗2 h，然后在超净工作台上用75% 酒精浸泡30～60 s，取出后用无菌水冲洗3～5次，之后放入0.1% 的HgCl2溶液中浸泡5～10 min，再用无菌水冲洗3～5 次，置于灭菌的滤纸上备用。

1.2 培养基类型

外植体经过消毒后需要接种到培养基中，研究发现外植体的类型不同，需要的培养基类型也不同。马佩[7]发现以油松成熟胚的子叶-胚轴段为外植体时，1/2MS 培养基诱导效果最好；以下胚轴段为外植体时，SH 培养基诱导效果最好[8]。而以未成熟合子胚为外植体时，mLV 培养基[9]效果最好，且能够诱导出胚性愈伤组织[10]。

1.3 植物生长调节剂种类

植物生长调节剂在体胚发生过程中发挥着重要作用，主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯和脱落酸，其中在愈伤组织诱导阶段主要用到的是生长素和细胞分裂素，常用的生长素包括IAA、IBA、NAA、2，4-D 等；细胞分裂素包括6-BA、ZT、KT 等。将不同质量浓度的生长素和细胞分裂素组合使用对油松胚性愈伤组织的诱导具有较好的效果。此外，在培养基中添加一些营养物质如谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖等也对油松胚性愈伤组织的诱导起着促进作用。李亦轩[10]以未成熟合子胚为外植体，mLV 为基本培养基并添加2 mg·L-12，4-D、1 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1水解酪蛋白、0.5 mg·L-1谷氨酰胺、30 g·L-1蔗糖以及2.5～3 g·L-1植物凝胶，接种后将培养皿放在培养室中进行暗培养，培养室相对湿度60%～70%，温度（25±3）℃，培养1 个月后油松胚性愈伤组织诱导率可达60%。

2 油松胚性愈伤组织的增殖

油松体胚发生体系的进一步成熟和萌发再生需要大量的胚性愈伤组织作为基础材料，因此对诱导出的油松胚性愈伤组织进行增殖十分关键。目前，常用的两种增殖方式为固体培养基培养以及液体培养基悬浮培养，二者都伴随有褐化现象。褐化的出现将影响其它健康组织的生长，甚至导致其死亡，危害性较大。为了控制油松胚性愈伤组织增殖过程中的褐化，付双彬[11]等对培养基配方进行优化并发现，以mLV 为基本培养基添加2.5 g·L-1植物凝胶、10 g·L-1蔗糖，pH 控制在5.9，且在90 mm 培养皿中放置7 块愈伤组织时，褐化率最低，增殖率和利用率最高。

利用锥形瓶进行悬浮培养，相对于固体培养基增殖培养速度较快，但仍然难以满足生产实验的大量需求，并且也遭受褐化影响，而使用气动生物反应器进行培养可以避免这些问题。气动生物反应器是一种新型培养方式，主要原理是空气进入生物反应器，在液体培养物中产生小气泡，这些气泡既搅动胚胎细胞团防止材料堆积，又向培养物提供空气[12]。李亦轩等[13]利用气动生物反应器对油松胚性愈伤组织进行增殖，发现每100 mL 液体培养基内接种10 g 油松胚性愈伤组织，添加0.2 mg·L-12，4-D，并保留20%的原培养基时增殖率最高，可达216.18%，且愈伤组织稳定优质。

3 油松体细胞胚的成熟

体细胞胚的成熟是植物体胚发生体系中至关重要的一步，是限制体胚技术商业化生产应用的重要因素，畸形胚和发育不完全胚将会影响后期体胚的萌发与植株再生[14]。影响油松体细胞胚成熟的因素主要包括ABA 浓度、愈伤组织生长情况、培养基渗透压和细胞系的基因型等。众多树种的体胚发生研究中均发现ABA 在体细胞成熟阶段发挥关键作用，尤其是在针叶树种中[14～15]。此外，在体胚成熟阶段经常通过添加PEG 来调节培养基渗透压，有研究表明经PEG 处理的愈伤组织细胞活力和有丝分裂能力均较高，有利于后续成熟培养[16]。李亦轩等[17]根据这些因素对油松体细胞胚成熟过程进行了优化，并发现在mLV 基本培养基中添加16 mg·L-1ABA、75 g·L-1PEG、5 g·L-1植物凝胶、（10+30）g·L-1麦芽糖和蔗糖时，油松体细胞胚的成熟效率最高，与对照相比提高了0.8 倍。

4 油松的遗传转化

油松作为一种针叶树种，传统育种周期长，难以满足树木遗传改良的需求，因此需要通过基因工程引入分子育种途径。建立油松遗传转化体系是实现这一途径的基础，而高效稳定的体细胞胚胎发生体系是油松遗传转化体系构建的重要前提。胚性愈伤组织是遗传转化体系最佳的受体材料，因为其再生能力强大，容易调控分化表达全能性，已被广泛应用于其它针叶树种的遗传转化研究[18]。目前，油松的体胚发生体系逐渐优化，可以较高效地获得油松胚性愈伤组织，这也为油松的遗传转化研究提供了实验材料。由于针叶树的遗传转化难度大，仍处于初步探索阶段。李亦轩[10]采用农杆菌转化法，以油松固体愈伤组织和液体悬浮组织为材料，研究发现卡那霉素Kan=50～75 mg·L-1时有利于转化，当OD 值在0.4～0.6，侵染时间为5～15 min，共培养时间为48 h，农杆菌与胚性愈伤组织状态良好，并能得到GUS 阳性的愈伤组织。尽管只有一种处理的转化效率相对较高，但是其愈伤组织可以被GUS 染液染成蓝色，说明结果可信，这对后续的实验提供了一个积极的影响，奠定了良好的遗传转化基础。

5 展 望

目前，油松胚性愈伤组织的诱导、增殖以及成熟3 个阶段已经被广泛研究并取得了较大的进步，可以获得大量的优质胚性愈伤组织，并筛选出了油松体细胞胚成熟的最佳条件。然而，体细胞胚的进一步萌发以及植株再生还没有实现，这制约着油松体胚发生技术的应用。此外，对油松胚性愈伤组织遗传转化的研究也停留在初步阶段。因此，在今后的研究中应该把重点放在体胚萌发及植株再生，并继续对油松遗传转化各阶段条件进行筛选，逐步完善油松体细胞胚胎发生体系。