乌鸡白凤片对大鼠胚胎-胎仔发育的毒性研究

孙 超，王玉晶，朱立欣，黄艳丽，汤连升

（1. 山东省药学科学院 新药评价中心，山东 济南 250101；2. 津药达仁堂集团股份有限公司乐仁堂制药厂，天津 300012）

乌鸡白凤片起源于中药经典名方，属于对传统名方的二次剂型升级，具有补气养血、调经止带功效，本品用于气血两虚、身体瘦弱、腰膝酸软、月经不调、带下[1]。中药因其成分复杂，给不良反应监控带来诸多困难[2]。成年女性是乌鸡白凤片的常用人群，但关于乌鸡白凤片对于妊娠期女性胚胎及胎仔发育的影响鲜有报道，故开展其临床前胚胎及胎仔发育的评价尤为重要。本文在GLP条件下，利用SPF级SD大鼠为实验动物，经妊娠期间重复给药，对SD大鼠进行胚胎-胎仔发育毒性的评价研究，为该药的临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠（维通利华实验动物技术有限公司），饲养于山东省药学科学院新药评价中心SPF级动物房，环境温度 20～26 ℃，日温差≤4 ℃，湿度 40 %～70 %，动物自由饮食饮水。本实验遵循实验动物使用的3R原则，对动物给予人道主义关怀。

1.2 受试物和主要仪器

乌鸡白凤片（津药达仁堂集团股份有限公司乐仁堂制药厂，批号：ZSWB210601）。

UW2200H电子天平（日本岛津）；TXB622L电子天平（日本岛津）；UlitiMate 3000高效液相色谱仪（Thermo）；LED数显加热型磁力搅拌器（BIOLOGIX）；游标卡尺（哈尔滨量具刃具集团）。

1.3 试验方法

1.3.1 剂量设计 根据药物非临床安全性研究技术指导原则及相关文献确定试验剂量[3-6]。乌鸡白凤片临床用法用量为每天给药2次，一次2片，每片0.5 g[1]。按照成人平均体重70 kg折算用量为28.6 mg/(kg·d)，大鼠的等效临床用量约为180 mg/(kg·d)。乌鸡白凤片最大可行性给药浓度为500 mg/ml，大鼠重复灌胃给药可接受最大体积为20 ml/kg。故本试验供试品设计低、中、高剂量组给药剂量分别为2.5，5.0和10.0 g/(kg·d)，分别约为人用临床剂量的87.4，174.8和349.7倍，大鼠等效临床剂量的13.9，27.8和55.6倍。同时设溶媒对照组（纯水）作为对照。

1.3.2 动物分组 将检疫合格的雌鼠与雄鼠l:l合笼交配，合笼后次日观察阴道栓脱落情况，发现阴道栓者确认为妊娠0天（GD0）[7]，将GD0雌鼠分组，未见阴道栓者继续交配，以每天确认受孕动物为基数采用普通拉丁法进行分组。

1.3.3 给药方法 将乌鸡白凤片粉碎至细粉后纯水搅拌混匀至所需浓度，采用HPLC法测定配制后制剂内芍药苷含量[8-9]。模拟临床给药途径采用经口灌胃进行给药，每天给药1次，给药周期为GD6～GD17，供试品组给药制剂在给药前置常温持续搅拌至混悬均匀，给药过程中持续搅拌。

1.3.4 指标检查[10]孕鼠检查：试验期间，所有孕鼠每天进行临床观察，定期进行体重和摄食量检测。孕鼠于GD20解剖观察，测定卵巢和子宫窝重，剖开子宫，暴露着床痕，依据着床痕的位置按照从右侧子宫角到左侧子宫角的顺序，以阿拉伯数字依次标记活胎，并标记吸收胎及死胎位置，计数黄体数、活胎数、死胎数、吸收胎数和着床数。

胎仔检查：活胎仔判断性别，测定体长、尾长和体重，进行外观检查。每窝取约半数活胎胎仔制作内脏标本；每窝剩余半数活胎胎仔制备成骨骼标本；对标本进行内脏和骨骼检查。

1.3.5 统计指标[11]孕鼠体重、摄食量、子宫（窝重）、卵巢湿重、胎仔窝平均体重、窝平均身长、窝平均尾长、黄体数、胎仔数（着床数）等数据采用单因素方差法进行统计分析。活胎率、死胎率、吸收胎率、外观畸形率、内脏畸形率、骨骼畸变率、骨骼变异率等指标采用χ2检验。所有检验结果以双侧检验显著性为准。

2 结果与分析

2.1 孕鼠检查

试验期间，各组孕鼠一般状态良好，未见由于给药引起的异常症状。试验期间，给药各组妊娠动物体重与溶媒对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药组动物部分时期摄食量较溶媒对照组小幅降低，但体重均未见影响，认为其主要原因为给药体积较大和给药制剂黏稠引起胃容量减少，导致的摄食量减少，属于非毒性因素。剖检各组孕鼠肉眼均未见明显脏器组织的异常。供试品各给药剂量组妊娠鼠子宫（窝重）和卵巢脏器湿重与溶媒对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表1～3。

表1 乌鸡白凤片对孕鼠体重指标的影响/g

表2 乌鸡白凤片对孕鼠摄食量指标的影响/g

表3 乌鸡白凤片对孕鼠生殖器官湿重的影响/g

供试品各组孕鼠黄体数及胎仔数（着床数）与溶媒对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。供试品各给药剂量组活胎率和死胎率与溶媒对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），供试品中、高剂量组动物吸收胎率与溶媒对照组比较降低，差异有统计学意义（P＜0.05），吸收胎率降低对生殖发育是有益的，提示SD大鼠妊娠期间给予供试品可能具有一定的保胎作用，其作用体机制待进一步研究。详见表4。

表4 孕鼠生殖功能指标统计结果

2.2 胎仔检查

供试品各给药组胎仔体重、身长和尾长与溶媒对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表5。

表5 胎仔发育和胎仔外观检查指标统计结果

溶媒对照组和供试品低、中剂量组胎仔外观检查均发现个别胎仔身体局部血肿或水肿现象，供试品高剂量组胎仔外观检查均未见异常。由于上述外观异常散在分布且出现的部位各不先相同，且无剂量相关性，判断为剖宫取胎仔过程中使用工器具物理损伤造成，与供试品无关。详见表5。

溶媒对照组胎仔内脏检查未见异常，供试品高剂量组有1例胎仔为小型大脑，其它均未见异常，供试品高剂量组胎仔内脏畸形率与溶媒对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），且畸形率很低，考虑为自发性畸形，故未进行供试品低、中剂量组胎仔的内脏畸形检查，提示妊娠大鼠连续给予供试品未见对胎仔内脏发育各检查指标的影响。详见表6。

表6 胎仔内脏和骨骼检查统计结果

溶媒对照组和供试品高剂量组胎仔骨骼检查主要异常为骨化不全和未骨化。骨化不全发生部位主要是颅骨背部上枕骨和胸骨，供试品高剂量组骨化不全变异率与溶媒对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），溶媒对照组和供试品高剂量组未骨化出现窝数分别为19/22，16/21，散在分布于各检查窝。未骨化发生部位主要为胸骨，供试品高剂量组未骨化畸形率与溶媒对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），溶媒对照组和供试品高剂量组未骨化出现窝数分别为15/22，12/21，散在分布于各检查窝。骨骼变异的骨化不全及畸形的未骨化异常，均可随胎仔出生后逐步恢复。提示妊娠大鼠连续给予供试品未见对胎仔骨骼发育各检查指标的影响。详见表6。

3 结论

本试验条件下，妊娠鼠于GD6～GD17日经口灌胃给予10 g/(kg·d)及以下剂量的乌鸡白凤片，对妊娠SD大鼠母体和胚胎未见毒性影响，胎仔发育正常，无致畸作用，妊娠SD大鼠母体NOAEL和胎仔NOAEL均为10 g/(kg·d)。乌鸡白凤片用于成年女性主要治疗子宫出血、月经不调、乳腺增生、高催乳素等症状[12-15]，对于妊娠期妇女，本品临床使用安全范围较大，安全窗较宽，是否有明显胎儿致畸风险还需更多临床验证。