土壤调理剂对露天煤矿排土场土壤酶活和微生物多样性的影响

于鑫鑫，王 芷，刘 莉

1.国能准能集团有限责任公司，内蒙古 自治区鄂尔多斯 010300；2.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；3.中国科学院上海高等研究院，上海 201210；4.上海有机固废生物转化工程技术研究中心，上海 200241

黑岱沟露天煤矿位于我国优质煤炭资源富集的内蒙古鄂尔多斯市，总占地面积65.46 km2，是我国建设的四大露天矿之一。近年来，矿区煤炭的大量开采造成了生态环境破坏和土地资源耗竭[1]。因此，提高矿区土地利用率、改善土壤生态环境意义重大。露天煤矿在开采过程中产生的损毁地主要为排土场，一般占矿山用地的50%以上[2]。排土场表层土壤存在孔隙度小、保水能力差、径流严重、养分贫瘠、微生物活性弱、不利于植物生长等问题[3]。

将土壤调理剂应用于土壤改良是当前研究的热点。土壤调理剂是指在障碍土壤中用来改善土壤的物理、化学、生物性状的物料，进而改良土壤结构、改善土壤水分状况或土壤生态环境。目前已有将有机肥、保水剂、微生物菌剂两两组合制成土壤调理剂的研究。如曹远博等[4]的研究表明，在黄土坡地使用保水剂和有机肥制成的土壤调理剂能够有效改善土壤的抗侵蚀能力，对削弱地表径流也有正面作用。蒋美佳等[5]发现有机肥和保水剂配施可有效减少氮素的淋失。王荣等[6]发现使用保水剂和有机肥的实验组与使用传统水溶肥的对照组相比，明显提高了0～20 cm 土壤的电导率和养分含量，降低了土壤酸碱度，进而提高了黄瓜的产量和营养质量。李想等[7,8]在废弃铁尾矿中使用了含有保水剂和有机肥的土壤调理剂，发现0～20 cm 层的土壤性质得到了明显改善，但是单独使用有机肥并不能达到这种效果；在此基础上，通过设置两种材料的不同使用条件和使用量，研究紫花苜蓿和紫穗槐的生长发育状况，结果表明20 L/m3的保水剂与22.49 kg/m2的有机肥对实验裸尾矿土壤的植物生长发育的促进效果良好。孔涛等[2]使用胶质芽孢杆菌与苜蓿根瘤菌双接种处理，显著提高了排土场的土壤熟化程度和复垦效果。在康藏高原地区以6 种牧草为实验对象进行土壤改良的田间实验，结果表明，在同一保湿处理下，多数牧草的各项测定指标表现为：菌剂与肥料配施>单施微生物菌剂>单施复合肥>不施肥，且在双倍保湿剂下表现更好[9]。宋双双等[10]将不同浓度的微生物菌剂与保水剂进行搭配，混合使用到种植油松和紫花苜蓿的土壤中，发现不同浓度组合对土壤速效养分含量的提升效果不同，高浓度的保水剂和菌剂会显著提高土壤速效氮的含量，中浓度的菌剂用量能使土壤持水能力得到提升，过量则会降低保水剂的保水效果。

本研究主要针对排土场土壤恢复利用后的种植层土壤进行改良，将有机肥、保水剂和微生物菌剂三者联合制成土壤调理剂来改善排土场土壤微生物环境。目前，共同使用这3 种材料进行矿区复垦土壤改良的研究较少，本研究不仅可为露天煤矿排土场复垦土壤的改良提供理论依据和参考数据，同时也能为其他干旱地区土壤改良提供研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤取自内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗黑岱沟露天煤矿排土场标高1 330 m 处的新排土样。土样自然风干，过孔径1 mm 筛，用于盆栽实验。该土壤pH 为8.7，电导率97 μs/cm，有机质含量为1.82 g/kg，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为32.67、2.0、148.72 mg/kg。实验使用的土壤调理剂中保水剂、有机肥、微生物菌剂的具体信息见表1。根据实地考察情况，小白菜为当地常见经济作物，且生长周期相对较短，因此以小白菜作为验证植物。

表1 实验材料

1.2 实验设计

本研究通过在温室中进行盆栽实验。利用塑料PP 盒做容器（直径11 cm，高11.5 cm 的圆柱体），使用电钻在底部均匀的打8 个直径1 cm 的孔用于排水，每盆装入1 kg 风干后的排土场土壤。根据前期实验研究，将5‰（以占盆栽用土总重量计算）保水剂和30%（以占盆栽用土总重量计算）有机肥与排土场土壤进行混合，均匀装入盆中。播散小白菜种子前，为每盆干土浇水500 mL，确保土壤完全湿透，然后添加微生物菌剂，微生物菌剂使用总量梯度设置为0 mL/盆、5 mL/盆、10 mL/盆，每次以设置的总使用量的1/5 混在浇灌用水中，第一次在播种前使用，后续每7 d 施用1 次；然后分别在第0、25 和50天3 个阶段取样检测土壤酶活和微生物多样性。设置4 个处理组，分别为对照组（CK）、5‰保水剂和30%有机肥（W0）、5‰保水剂和30%有机肥以及5 mL 微生物菌剂（W1）、5‰保水剂和30%有机肥以及10 mL 微生物菌剂（W2），每个处理均设置3 次重复。

1.3 土壤指标测定

1.3.1 6 种土壤酶活

土壤酶活采用《土壤酶及其研究方法》[11]进行测定。其中，过氧化氢酶（S-CA）酶活采用比色法测定，纤维素酶（S-CL）酶活采用3，5-二硝基水杨酸法测定，蔗糖酶（S-SC）酶活采用3，5-二硝基水杨酸法测定，脲酶（S-UE）酶活采用苯酚钠比色法测定，碱性磷酸酶（S-AKP）酶活采用磷酸苯二钠比色法测定，碱性蛋白酶（S-ALPT）酶活采用比色法测定。

1.3.2 土壤微生物多样性

每个土壤样本称取10 g（每个样本由对应的3个平行样混合均匀），交付上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，包括土壤总DNA 的提取、纯化与定量，以带有barcode 序列的338F-806R 为引物进行PCR 扩增，PCR 扩增采用细菌通用引物为338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’及806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.4 数据分析

通过SPSS 软件进行数据分析，所有实验重复3次，结果显示平均值、±标准误差；采用Origrin9.1 进行绘图；微生物多样性分析采用Illumina 公司Miseq PE300 平台。

2 结果与分析

2.1 土壤调理剂对土壤酶活的影响

对各组土壤在3 个时间点的过氧化氢酶（SCA）、纤维素酶（S-CL）、蔗糖酶（S-SC）、脲酶（SUE）、碱性磷酸酶（S-AKP）、碱性蛋白酶（S-ALPT）这6 种酶的酶活进行重复测量方差分析，探究4 个分组的土壤条件是否会对6 种酶活性产生影响，得出主体间效应检验结果，见表2。

表2 6 种土壤酶活性的主体间效应检验

2.1.1 土壤调理剂对土壤过氧化氢酶（S-CA）酶活的影响

从图1 中可以看出，CK 组过氧化氢酶（S-CA）酶活随着种植时间的增长，活性呈下降趋势，但添加了土壤调理剂的3 组处理随着种植时间的改变，其过氧化氢酶酶活均呈现先增高后降低的趋势。在第0 天时，添加了土壤调理剂的土壤并没有比对照组拥有更高的过氧化氢酶活性，但是到25 和50 d 时，只要添加了保水剂与有机肥的土壤，其过氧化氢酶活性都显著提高，而菌剂的两个不同使用量处理组并没有带来更有效的结果。

图1 土壤酶活变化

2.1.2 土壤调理剂对土壤纤维素酶（S-CL）酶活的影响

从图1 中可以看出，所有处理组的土壤纤维素酶（S-CL）酶活随着种植时间的增长，均呈现出先升后降的趋势。所有分组第0 天的纤维素酶酶活无显著差异。在第25 天和第50 天时，发现使用5 mL 菌剂的组始终拥有明显的高纤维素酶活性，使用了保水剂和有机肥的组较对照组也拥有更显著的高纤维素酶活性。

2.1.3 土壤调理剂对土壤蔗糖酶（S-SC）酶活的影响

从图1 中可以看出，无论在哪个种植时间点，3个实验组的蔗糖酶（S-SC）酶活都显著高于CK 组。在同一时间下，分析各处理组之间的蔗糖酶酶活差异发现，有机肥和保水剂的添加能够明显提高土壤蔗糖酶活性，但菌剂的两个使用量对于土壤蔗糖酶活性没有明显影响。

2.1.4 土壤调理剂对土壤脲酶（S-UE）酶活的影响

从图1 中可以看到，随着种植时间的变化，除了添加10 mL 微生物菌剂的处理组呈现脲酶（S-UE）酶活逐步降低的趋势，其他3 组均呈现先降低后升高的变化趋势。在同一时间下，对照组的土壤脲酶活性在任何时间内均显著低于其他处理组，说明有机肥和保水剂的添加能够提高土壤脲酶活性，但菌剂的两个使用量并没有对土壤脲酶活性带来明显改变。

2.1.5 土壤调理剂对土壤碱性磷酸酶（S-AKP）酶活的影响

从图1 中可以看出，除添加了10 mL 微生物菌剂的土壤碱性磷酸酶（S-AKP）酶活随着种植时间的变化呈现先升高后降低的趋势外，其余所有处理组均呈现随种植进程活性逐渐升高的趋势。在任何一个时间点，对照组的碱性磷酸酶活性均显著低于其他的改良处理组，但各处理组之间差异均不显著。这说明有机肥和保水剂的添加对于土壤碱性磷酸酶的活性有提升作用，但菌剂的两个使用量没有带来类似的效果。

2.1.6 土壤调理剂对土壤碱性蛋白酶（S-ALPT）酶活的影响

从图1 中可以看出，随着种植进程的时间变化，CK 组的土壤碱性蛋白酶（S-ALPT）酶活呈现先降低后升高的趋势，而其余3 个处理组均呈现逐步升高的趋势。根据主体间效应检验结果可知，分组不起作用，即土壤碱性蛋白酶活性不受土壤改良材料的影响。

2.2 土壤调理剂对土壤微生物多样性的影响

由高通量测序结果进行OTU 物种分类可知，在12 个样本中共检测出40 个细菌门。在进行数据分析前先对所有样本按照最小样本数进行抽平，抽平序列数为27 142 条序列，选取相关指标进行Alpha多样性分析，结果如表3 所示。

表3 不同处理组对土壤微生物多样性的影响

如表3 所示，所有处理组在任何时期的样本测序覆盖度均达到98.50%以上。Sobs 指数值越大，代表群落丰富度越高。分析可知，随着时间的变化，4个分组群落丰富度逐渐升高；在同一时间的土壤样品中，CK 组的群落丰富度明显低于其余3 个处理组；对于3 个菌剂添加量不同的处理组，在第0 天时，菌剂添加量多的样本土壤微生物丰富度反而更低，但到中后期阶段，能看到添加菌剂组的土壤微生物丰富度已然追赶上来，说明所用的菌剂产品和用量可能在长时间下才能对实验土壤发挥作用。Shannon 指数能够反映群落的多样性，Shannon 指数值越大，代表群落拥有越高的多样性。由上表可知，各处理组随着时间的变化，Shannon 指数总体呈上升趋势；在3 个检测时间点，CK 组的Shannon 指数均低于其余3 个处理组，说明添加土壤调理剂，增加了土壤微生物多样性；仅微生物菌剂用量不同的W0、W1、W2 组整体上来讲，微生物菌剂用量越多，微生物多样性越高，说明菌剂的添加有利于提高土壤中微生物的多样性水平。

2.3 土壤调理剂对土壤微生物群落组成的影响

在门水平上对所有样本的细菌群落结构进行分析并绘制bar 图，见图2。

图2 门水平上不同样本的土壤细菌组成相对丰度

在门水平上将样本中相对丰度<1%的类群归为其他，相对丰度>1%的类群有12 个，如图2 所示。可以看到，在所有样本中，放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）的含量都是最多的，且在任何一个样本中，两种菌门的总丰度均超过了50%，说明放线菌门和变形菌门在实验土壤中是主要优势类群。到后期时，对照组土壤中的放线菌门丰度大幅度降低，而变形菌门丰度却大幅度提高，两者丰度总量轻微下降，其他3 个处理组在两个菌门丰度上变化趋势也与之相似，但变化程度没有对照组大，且丰度总量始终小于对照组。可以看到，对于其它菌门来说，在任何一个时间内，3 个处理组丰度明显高于对照组，且10 mL 菌剂处理组在第50 天时的混合土样中，除上述两菌门外的菌门总丰度超过了40%。在所有样本中平均丰度第3～12 名的菌门分别为绿弯菌门（Chloroflexi）、 拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞杆菌门（Gemmatiomonadota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、粘球菌门（Myxococcota）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcota）、蓝细菌（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、蛭弧菌门Bdellovibrionota。相比对照组，3 个处理组中绿弯菌门和拟杆菌门的含量要明显更高，随着时间变化，各处理组中这两个菌门总含量逐渐增多。4 个处理组随着时间变化，各自样本中厚壁菌门的含量均呈逐渐下降的状态，但处理组含量始终高于对照组，且在第0 天时，各处理组中厚壁菌门含量的排名为W2>W1>W0>CK（见图3）。对于芽单胞杆菌门、髌骨细菌门、粘球菌门、异常球菌-栖热菌门这4 个菌门，在处理组的含量均高于对照组。对照组在3 个时期的蓝细菌含量要明显多于其他3 个处理组，且对照组随着时间变化，蓝细菌含量也逐渐升高。对于放线菌门和Bdellovibrionota这两个菌门，在4 个分组中含量相对较少，且两个菌门的最大含量分别出现在对照组的第25 天和第50天的土壤样品中。对于被归为其他的类群，在4 个分组中随着时间进程，丰度均呈现增加的状态。

图3 门水平上的VENN 图

从VENN 图中，能够清楚地看到不同处理组在不同时间下的菌门种类数量、共同含有的菌门和独有菌门。可以看到，对照组在0～25 d 含有的菌门总数没有变化，25～50 d 增加了2 个菌门；W0 组在0～25 d 含有的菌门总数也没有变化，25～50 d 只增加了1 个菌门；W1 组在0～25 d 含有的菌门总数增加了5 种，但是25～50 d 没有变化；W2 组在两个阶段分别增加了5 个菌门和3 个菌门，成为菌门数数量最多的组。整个时间进程里，4 个处理组的共有菌门数从16 个增加到了19 个，说明可能是种植小白菜带来的共同改变。但是观察4 个处理组的特有菌门发现，只有对照组的独有菌门数量最多，且到后期增加到4 个菌门，分别是GAL15、迷踪菌门（Elusimicrobiota）、梭杆菌门（Fusobacteriota）和硝化螺旋菌门（Nitrospirota），W0 组最后的独有菌门是Hydrothermae，而W1 和W2 组最终没有独有的菌门。

为了解样本间的细菌群落Beta 多样性差异，对4 个处理组的12 个样本，在3 个时间点上，分别进行OTU 水平上的PCA 分析，结果如图4 所示。

图4 OTU 水平上的PCA 分析

由PCA 分析结果图可以清楚地看到，无论在哪个种植期，对照组与3 个处理组之间在OTU 水平上的物种组成差异显著。根据12 个样本在图中的象限分布可知，只要使用了保水剂和有机肥的土壤在同一种植时间的土壤细菌多样性没有显著差异，但3个有改良材料的处理组在初始第0 天的土壤细菌多样性明显与后期的不同，25 d 和50 d 的区别不明显，说明随着种植时间的增长，土壤微生物环境发生了变化。

综上可知，保水剂与有机肥的使用能显著改变土壤微生物环境，且随着时间的推移能够发生进一步改变，但是微生物菌剂的两个用量带来的影响不显著。

2.4 土壤微生物与6 种土壤酶活的关联性分析

从图5 中可以明显看出，只存在与土壤过氧化氢酶酶活有显著负相关性的菌门——装甲菌门（0.05 显著水平），由此可推测，因为对照组中高丰度的装甲菌门导致其过氧化氢酶酶活整体显著低于处理组。土壤纤维素酶酶活不受这15 种菌门影响，同样也验证了是否添加保水剂和有机肥对其没有影响。与土壤脲酶酶活有显著正相关性的菌门，只有拟杆菌门（0.05 显著水平）和热脱硫杆菌门（0.1 显著水平），相反有显著负相关性的菌门有蓝细菌门（0.05显著水平）、装甲菌门、硝化螺旋菌门和变形菌门（0.1 显著水平）。推测是对照组中低丰度的拟杆菌门以及高丰度的蓝细菌门、变形菌门、装甲菌门、硝化螺旋菌门导致其脲酶活性整体显著低于处理组。第25 天时，使用菌剂组的脲酶酶活显著高于不使用组的原因可能是使用组的热脱硫杆菌丰度更高。与土壤蔗糖酶酶活有显著正相关性的菌门，分别是拟杆菌门和厚壁菌门（0.05 显著水平），有显著负相关性的菌门有蓝细菌门（0.01 显著水平）、装甲菌门（0.05显著水平）和蛭弧菌门（0.1 显著水平）。推测是对照组中低丰度的拟杆菌门、厚壁菌门以及高丰度的蓝细菌门、装甲菌门、蛭弧菌门导致其蔗糖酶酶活整体显著低于处理组。与土壤碱性蛋白酶酶活有显著正相关性的菌门，分别是蛭弧菌门（0.05 显著水平）、装甲菌门、栖热菌门和酸杆菌门（0.1 显著水平），而有显著负相关性的菌门是放线菌门（0.1 显著水平）。推测主要是因为随时间变化，各分组土壤中的蛭弧菌门丰度均升高导致各分组的碱性蛋白酶活性升高。与土壤碱性磷酸酶酶活有显著正相关性的菌门，分别是绿弯菌门、浮霉菌门（0.01 显著水平），粘球菌门、Sumerlaeota（0.05 显著水平），栖热菌门、疣微菌门、芽单胞杆菌门、髌骨细菌门（0.1 显著水平），相反，有显著负相关性的菌门只有硝化螺旋菌门（0.1显著水平）。推测是对照组中低丰度的绿弯菌门、芽单胞杆菌门、粘球菌门、栖热菌门、疣微菌门、髌骨细菌门以及高丰度的硝化螺旋菌门导致其速效钾含量显著低于处理组。

图5 基于门水平的物种与土壤酶活性关系热图

3 讨论

实验结果显示，碱性蛋白酶酶活只随着种植时间进程而逐渐升高，并不受土壤调理剂添加的影响，推测可能是小白菜根系分泌物影响了其活性，而微生物菌剂的使用并没有使其他种类的酶活性发生显著变化。以往的许多研究表明，微生物菌剂的使用能够影响土壤酶的活性。例如宋以玲等[12]研究发现，在种植棉花的土壤中分别使用灭菌和常规的复合微生物菌剂会对土壤性质、微生物环境以及棉花的生长发育情况带来不同程度的效果，但整体上来看，两种菌剂的使用都能提高土壤脲酶和蔗糖酶的活性，此外菌剂用量的变化对土壤不同酶活性的影响也有差别。借此推测，可能是本实验使用的菌剂产品不适合使用的土壤，但其中的具体原因还需对菌剂的成分进行研究后才能决断。针对过氧化氢酶、纤维素酶以及过氧化氢酶酶活随时间呈现先升高后降低的规律，推测可能是受土壤微生物环境的影响，也可能受土壤pH 或者养分的影响。对此，前人也进行了大量研究，但结果并不相同。有研究[13]发现，土壤酶活性与土壤有机质含量相关，但与土壤有效磷、速效钾等养分间并不存在显著相关，也有研究[14]认为土壤微生物数量与土壤肥力具有显著的相关性，微生物数量的增多能够改善土壤结构，从而促使养分循环速率，而土壤酶活性的升高也常伴随着土壤熟化程度的提高。本实验中还能看到蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶和纤维素酶的活性在有保水剂和有机肥的处理下明显要高于对照组，只能说明这两种改良材料的实验用量组合添加相比对照组对这几种酶的活性具有提高作用。如果想知道每种酶活性具体受哪种材料的影响以及用量的影响，还需要进一步实验分析。

一般认为，微生物群落多样性水平高的土壤拥有更强的抗逆能力，本实验中所有处理组随时间而增加的土壤微生物群落丰富度和多样性，不但说明小白菜根系的生长发育为土壤微生物环境带来改变，使土壤质量向良好方向发展，同时也验证了以往研究中植物在生长过程中会对土壤微生物群落产生影响的结论。也有许多研究[15-16]表明，植物类型不同，对土壤微生物环境带来的影响也会不同。关于保水剂对土壤微生物环境的影响研究也有很多，沈颖[17]的研究结果表明，其所使用的保水剂对土壤细菌群落没有显著影响。本研究中的保水剂种类及用量是否起到了显著提升土壤微生物群落多样性还有待于进一步的实验分析确定。

本研究发现，拟杆菌门丰度增加与土壤过氧化氢酶、蔗糖酶活性的提高具有相关性；绿弯菌门丰度的增加起到了提高土壤碱性磷酸酶活性的作用；厚壁菌门丰度的增加有起到提高蔗糖酶活性的作用；粘球菌门丰度的增加起到了提高土壤碱性磷酸酶活性的作用；单胞杆菌门丰度的增加起到了提高碱性磷酸酶活性的作用；变形菌门是土壤细菌中的最大一门，在多种类型土壤中的丰度都较高，有研究认为变形菌门对重金属有较好的耐受力[8]，本实验中变形菌门丰度的提升起到了降低土壤脲酶活性的作用；经研究，蓝细菌门大多具有固氮作用，而实验结果证明，蓝细菌门丰度增加主要起到了降低土壤脲酶、蔗糖酶活性的作用；蛭弧菌门丰度的提升起到了提高碱性蛋白酶活性的作用；装甲菌门丰度的提升起到了降低土壤过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶活性的作用。硝化螺旋菌门丰度提升起到了降低脲酶、碱性磷酸酶活性的作用。而土壤碱性磷酸酶活性的提高也受热脱硫杆菌、栖热菌门、疣微菌门和髌骨细菌门丰度增大的影响。

4 结论

使用由保水剂、有机肥和微生物菌剂制成的土壤调理剂能够提高土壤过氧化氢酶、纤维素酶、蔗糖酶、脲酶和土壤碱性磷酸酶的活性。土壤微生物群落丰富度和多样性随着小白菜种植时间进程均有提升，使用土壤调理剂的土壤能够实现更高的土壤细菌群落丰富度和多样性，土壤中的优势菌门始终是放线菌门和变形菌门，提升土壤酶活性的菌门有拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、粘球菌门和芽单胞杆菌门，起到与之相反作用的有变形菌门、蓝细菌门、蛭弧菌门、装甲菌门和硝化螺旋菌门。