代谢型谷氨酸受体5 的纯化及纳米抗体的筛选

王 辉，马梦洁，许剑锋*

1.上海海洋大学，上海 201306；2.中国科学院上海药物研究所，上海 201203;3.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306

谷氨酸（Glutamate，Glu）主要是在Glu 受体（Glu receptor，GluR）介导下调节大脑神经元兴奋性和代谢活动的重要兴奋性神经递质之一，代谢型谷氨酸受体（Metabotropic glutamate receptors，mGluR）属于谷氨酸受体的一种类型（另一类为离子型谷氨酸受体），该受体是GPCR 家族C 组成员[1]。mGluR5 主要以二聚体的形式分布在大脑皮质、海马和纹状体等区域，通过激活信号通路，广泛参与调控突触传递、突触可塑性、神经兴奋性/抑制性平衡等生理过程，对维系神经网络至关重要[2]。在病理条件下，它是一种公认的治疗靶点，与多种脑疾病有关。尽管有可靠的临床前数据，但mGluR5 拮抗剂在几项临床试验中都失败了，这表明需要深入地了解mGluR5 功能背后的机制[3]，其作为神经和精神疾病的潜在药物靶标日益受到相关研究人员的关注。

纳米抗体只包括一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，不像经过人工改造的单链抗体片段（scFv）那样容易互相沾粘，甚至聚集成块[4]。相反，其具备分子质量小，能够穿透血脑屏障，特异性和亲和力高，表达量高和对人体的免疫原性较弱等优势。本文通过对骆驼免疫，筛选出与mGluR5特异性结合较高的纳米抗体，然后以纳米抗体为中间体进行一系列改造，使mGluR5 靶向成药成为可能[5]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DNA Polymerase、T4 DNA Ligase 从南京诺唯赞购入；淋巴细胞分离液从GE Healthcare 公司购入；RNeasy PlusMiniKit 从 QIAGEN 公司购入；TIANquick Midi Purification Kit、TIANgel Midi PurificationKit 均购自天根生化科技（北京）有限公司；293s 细胞、M13KO7 辅助噬菌体购自NEB 公司；Mouse Anti- HA-tag Antibody、HRP Goat Antimouse IgGH+L）Antibody 从上海翌圣生物科技有限公司购入；M2 亲和层析柱；Ni-NTA His 结合树脂从Sigma 公司购入。

1.2 方法

1.2.1 mGluR5 真核表达载体的构建

从NCBI 上查找编码野生型人mGluR5 的21-835 位氨基酸残基的碱基序列，将血凝素（HA）信号肽、标志表位标签（DYKDDDDK）和3-丙氨酸连接物添加到N 端，然后在苏州金唯智生物科技有限公司合成，设计上游引物、下游引物；将改造后的mGluR5 和CMV-Flag 载体进行双酶切，酶切后的产物提纯后进行连接，将连接好的产物用Top10 感受态细胞进行转化，次日随机挑取转化出来的细菌，用上下游引物进行菌落PCR，将菌落PCR 结果为阳性的进行质粒测序，和原始序列进行对比[6]。

1.2.2 mGluR5 的表达纯化

利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统（Invitgen）制备重组杆状病毒[7]。800 mL 293 s 细胞，病毒比例1∶20，用10 mM 正丁酸钠30 ℃和135RPM 诱导3 d，离心收集细胞，在含有10 mM Tris 和1 mM EDTA 的低渗缓冲液中（pH 为7.8）和1 mM EDTA中裂解，然后匀浆[8]；用离心法收集细胞膜微球，分别用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，1% Coaktail，10 μM FFMTEP，0.2%胆固醇琥珀酸半酯（CHS）（类固醇）和10 μM FFMTEB（化合物）在4 ℃冷库旋转孵育2 h。FFMTEB（3-fluoro-5-（2-（2-（fluoromethyl）thiazol-4-yl）ethynyl）benzonitrile）是F-MTEB 的氟化类似物，对mGluR5具有极高的亲和力及选择性；用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，10 μM FFMTEP，2 mM CaCl2洗涤[9]。与M2 柱子结合的mGluR5 在20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，0.005% （W/V）LMNG，10 μM FFMTEP，0.2 mg/mL flag 和5 mM EDTA 洗脱。蛋白经50 kDa 截留的Vivaspin（微孔）滤膜浓缩，浓缩至500 μL 过Superose 6，10/300 GL 柱（GE Healthcare）进行分离，测浓度计算质量，在蛋白中称取3 倍质量的A835，混合均匀吸取蛋白体积1/2 活化的Bio-beads（500 uL），将蛋白加入其中，4 ℃旋转过夜吸附Detergent后，换等量的活化Bio-beads 4 ℃旋转吸附4 h，经吸附A835 包装后的蛋白过Superose 6 柱子进行分离[10]。通过SDS-PAGE 凝胶电泳确认蛋白。

图1 mGluR5-CMV-Flag 载体的构建

图3 噬菌体展示抗体库的构建

图4 抗mGluR5 纳米抗体的筛选

1.2.3 mGluR5 蛋白免疫野生单峰驼

将1 mg mGluR5 蛋白与GERBU Adjuvant FamaTM 佐剂按1∶1 混匀，注射于野生双峰驼颈部的淋巴结处，总共需要对骆驼进行7 次免疫，每次间隔时间为1 周，最后一次免疫1 周后抽取200 mL骆驼的外周血[11]。

1.2.4 噬菌体展示抗体库的构建

将150 mL 的骆驼外周血与等体积的0.9%氯化钠溶液轻晃混匀，将稀释的外周血按10 mL 每管慢慢注入15 mL 每管淋巴细胞分离液液面上，通过低速离心使外周血分为4 层，用移液枪小心吸出淋巴细胞层进行总RNA 的提取，再逆转录为cDNA[12]。用表1 中的引物对cDNA 进行巢式PCR 将VHH 片段进行扩增并与pMECS 噬菌粒载体进行连接；用电转化的方法转化到TG1 大肠杆菌中（条件为：电压1 800 V，电阻200 Ω，电容25 μF，时间恒定值在4.5～5.5 ms 之内）；用SOC 培养基进行复苏1 h，吸出10 μL 细菌悬液加入到990 μL 37 ℃预热的SOC 培养基中，混匀；取100 μL 涂布在含2%葡萄糖，氨苄抗性的9 cm 直径LB 平板上（即稀释103 倍，可进一步梯度稀释至104 倍、105 倍和106 倍），37 ℃倒置培养过夜后，统计菌落数用来测噬菌体抗体库的库容[13]。将剩下的细菌悬液每200 μL 涂布在1 块含2%葡萄糖，氨苄抗性的15 cm 直径LB 平板上，37℃倒置培养过夜；用6 mL LB 培养基润湿15 cm 直径LB 平板，用无菌细胞刮将细菌收集到一个100 mL 收菌瓶中；取10 μL 细菌，稀释200 倍，测量并记录OD600nm值（扩增倍数为104 以上）；向收菌瓶中加入1/3 体积的无菌80%甘油，混匀后在保存在-80 ℃; 随机挑取20 个菌落，从9 cm 直径LB 平板上，用MP57 引物和GIII 引物进行菌落PCR（如果连接体系中每100 ng 载体的转化效率低于5×105，或插入抗体片段的比例小于75%，则需要重新进行酶切和连接）[14]。

表1 VHH 片段PCR 扩增引物

1.2.5 mGluR5 特异性纳米抗体的液相淘选

将M13KO7 辅助噬菌体和文库菌按20∶1 的量进行混匀，在37 ℃的培养箱中孵育30 min，用3 200 g 离心10 min 弃去多余的噬菌体，再用2×YT/Amp/Kana 培养基，将菌重悬起来过夜培养；次日3 200 g 离心取上清，用1/4 倍体积的PEG/NaCl 沉淀噬菌体0.5 h 后离心弃上清，用PBS 重悬噬菌体后测滴度备用[15]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotinbinding protein 的PBS 4 ℃过夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），弃去NeutrAvidin，用含1% BSA的Buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）洗5 次，加入2% BSA 封闭2 h，洗去BSA，实验组加入5 μg/mL 抑制状态的mGluR5 抗原稀释液封闭30 min（对照组不加抗原），洗去抗原稀释液，加入1×1012CFU/孔噬菌体稀释液封闭2 h，洗去噬菌体封闭液，加入25 μg 胰酶消化30 min，加入1/20 体积的4 mg/mL AEBSF 来终止胰酶消化[16]。实验组/对照组各取10 μL 洗脱噬菌体进行10 倍梯度稀释，测定Output 噬菌体的滴度。计算特异性结合的富集率，如需新一轮淘选，过程同上[17]。

1.2.6 mGluR5 特异性纳米抗体的鉴定

从最后一轮淘选的TG1 大肠杆菌中随机挑选单克隆制备母板，从制备的母板中吸取20 uL～1 mL的2×YT/Amp 刻培养基中，220 r/min、37 ℃培养5 h后加入IPTG 进行过夜诱导表达纳米抗体[18]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotin-binding protein 的PBS 4℃过夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），次日将菌液离心后弃去上清，每孔加入100 uL 的PBS进行反复冻融裂解细菌，离心后取上清备用；用含1% BSA 的buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）将过夜包被的96 孔板洗5 次，加入2% BSA封闭2 h，洗去BSA，加入5 μg/mL 抑制状态的mGluR5 抗原稀释液封闭30 min；洗去未结合的抗原，加入备用的纳米抗体孵育1 h，加入Mouse Anti-HA-tag Antibody 稀释液孵育1 h；洗去一抗加入HRP Goat Anti-mouse IgG（H+L）稀释液孵育1 h，洗去二抗采用ELISA-TMB 显色试剂盒进行显色[19]。用SpectraMax M5 Microplate reader 在450 nm 处读取光吸收值，将吸收值大于对照组3 倍以上的纳米抗体进行测序，用Vector NTI 软件对碱基序列进行分析[20]。

2 结果讨论

2.1 mGluR5 真核表达载体的构建

mGluR5 片段大小为2 529 bp，将mGluR5 片段进行PCR 扩增后，用1%的凝胶进行电泳验证结果（图1a）与目的条带相符合，将mGluR5 片段构建到CMV-Flag 载体中（图1b），进行菌落PCR 验证的结果（图1c）。

2.2 mGluR5 的表达纯化

将蛋白表达后融膜进行纯化，用Superose 6，10/300 GL 柱进行分离（图2a），将锋尖蛋白跑SDSPAGE 凝胶电泳确认蛋白大小，确认锋尖蛋白为目的蛋白（图2c），经吸附过后A835 包装后的蛋白过superose 6 柱子（图2b）进行分离，将锋尖蛋白跑SDS-PAGE 凝胶电泳进行确认（图2d），确认锋尖蛋白为目的蛋白收集峰尖蛋白，将浓缩至一定浓度，加甘油分装冻存。

2.3 噬菌体展示抗体库的构建及库容的测定

对分离后的淋巴细胞总RNA 进行提取，RNA提取结果如图3a，用巢式PCR 对250～500 bp 之间的VHH 片段进行扩增（图3b），将扩增后的片段插到pMECS 噬菌粒载体中，通过电转化将构建好的质粒转化到TG1 电感受态细胞中，进行噬菌体展示抗体库的构建；通过测量大肠杆菌转化的效率对库容进行计算5.47×108CFU/mL，阳性率为95%（图3c）。

2.4 mGluR5 特异性纳米抗体的液相淘选

利用抑制状态的mGluR5 对构建的噬菌体展示抗体库进行液相淘选，经过两轮的富集淘选，实验组比对照组的富集度达到了30 倍（图4a），用最后一轮洗脱的噬菌体侵染TG1 大肠杆菌，按合适的倍数进行稀释，涂布到150 mm 的2×YT/Amp/Glu 平板上，随机挑取190 个单克隆进行纳米抗体的粗表达，通过Elisa 进行验证结合，淘选出12 个读数较高的纳米抗体，用Vector NTI 对纳米抗体进行序列分析（图4b）。

3 讨论

纯化出抑制状态的mGluR5，通过免疫双峰驼构建了库容为5.47×108CFU/mL 阳性率为95%的噬菌体文库，并通过噬菌体展示技术，筛选出了12 个不同的阳性克隆。本研究获得的高亲和力纳米抗体可以为研究mGluR5 蛋白的性质和介导的信号通路提供很好的纳米抗体工具，为mGluR5 的深层次研究奠定了基础。

mGluR5 是信号通路中的一个重要蛋白，调控着众多信号传导，通过作用于它，可以治疗很多相关疾病，顺利构建纯化出人的抑制型mGluR5 蛋白；利用包裹A8-35 的方法对蛋白进行生物素化，很好地避免了淘选时对蛋白表位的遮挡，通过多次液相淘选，可以筛选出各个表位、高亲和力的纳米抗体。传统的抗体体积都比较大，纳米抗体具有体积小特异性强等特点，可以更好地与mGluR5 蛋白结合并且减少对蛋白结构性质的影响；笔者成功免疫双峰驼筛选出抑制型mGluR5 蛋白的纳米抗体，为后续研究mGluR5 奠定了基础。

mGluR5 蛋白是一个很有潜力的靶点，直接作用于它是比较困难的，现有的一些激动剂或抑制剂都有一定的局限性，可以通过改造与mGluR5 蛋白特异性结合的纳米抗体来间接作用于它，开发和运用一些具有高选择性的激动剂和拮抗剂。这为研究mGluR5 蛋白的性质和介导的信号通路提供了方法，可以推动mGluR5 与中枢神经系统疾病的研究，为神经系统疾病的治疗提供新思路，最终能够达到治疗疾病的目的。