土壤水分胁迫对不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶含量的影响

刘军民，潘倍莎

1.中共舟曲县委组织部，甘肃 甘南 746300；2.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070

在我国干旱、半干旱的黄土丘陵区，土壤水分影响着植物生理生态特性和生理生化特性[1]。在生长发育过程中，不同的水分胁迫会对植物的生长和生存带来不同的影响[2]，所以对植物的抗旱性进行研究具有必要性。

紫花苜蓿（Medicago sativa L）是干旱、半干旱地区普遍种植且产业化发展前景良好的优良牧草品种，虽其耐旱性强，但需水量也高，故缺水是限制其生长及牧草产量的主要因素[3]。新疆大叶苜蓿（Medicago sativa L .cv .Xingjiang Daye）是西北地区大面积种植的紫花苜蓿品种，土壤水分对其生长发育及生理生化特性有着十分重要的影响，进而可能会影响到其产量和品质。因此，研究新疆大叶苜蓿在不同水分条件下的生理生化特性至关重要。

在植物抗旱生理研究中，MDA 含量是一个常用指标。植物器官在逆境下遭受伤害，往往会发生膜脂过氧化作用，MDA 从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸发生反应，使之丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成，因此，MDA 的积累会对膜和细胞造成一定的伤害，反过来说，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。植物在干旱条件下会产生大量的活性氧，如超氧化阴离子、过氧化氢、羟自由基等[4]。活性氧具有很强的化学活性[5]，能够改变蛋白质结构，使核酸断裂突变，损坏细胞膜，而抗氧化酶可以减少这种伤害[6]。在植物体抗氧化过程中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等各自分工，能够清除部分活性氧自由基，减少活性氧对植物体的伤害[7]。在已有的研究中，月季在生育过程中MDA 含量呈缓慢增长趋势[8]，唐苜蒲衰老过程中，MDA 含量一直在增长[9]，含醉花在发育过程中MDA 含量逐渐增高[10]。

因此，研究土壤水分胁迫对不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶活性的影响，被认为是培育耐旱基因植株富有前途的课题。

本研究通过在不同土壤水分胁迫下，研究不同茬次新疆大叶苜蓿叶片中抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性和MDA 的酶含量，对数据进行整理，为干旱、半干旱地区植物的抗旱性研究提供科学依据，以期提高其产量，发挥其优良生态和经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验地点

盆栽试验于2020 年甘肃农业大学林学楼下模拟径流场内（103.69°E，36.09°N；海拔1 534.2 m）进行，属于温带大陆性气候。

1.2 试验内容与方法

1.2.1 试验内容

通过测定不同水分条件下不同茬次的新疆大叶苜蓿丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性，分析土壤水分胁迫对不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响，为紫花苜蓿在干旱、半干旱地区的种植提供参考依据。

1.2.2 试验方法

采用盆栽观测的方法：盆栽实验选用圆柱形聚乙烯桶，桶内装上过筛壤土，栽植新疆大叶苜蓿。

返青后用称重法控制土壤水分，试验设3 个处理，即土壤水分含量保持田间持水量的85 %，土壤水分含量保持田间持水量的65%，土壤水分含量保持田间持水量的45%。每个处理12 桶，共36 桶新疆大叶苜蓿。

生育期内的全部降水用防雨棚遮去，每晚用称重法均匀浇水，平衡桶重，并记录每天的耗水量。

1.2.3 试验材料

两年生的新疆大叶苜蓿。

1.2.4 测定方法

（1）过氧化物酶（POD）活性：愈创木酚比色法

在比色杯中依次加入0.05 mL 的上清液、2.65 mL 的0.3%愈创木酚，将比色杯放入分光光度计的比色槽中，加入0.3 mL 的0.6% H2O2（比色杯中液体总体积为3 mL），立即按开始键，自动计时2 min，记录470 nm 处OD 值，按式（1）计算POD 活性。

（2）超氧物歧化酶（SOD）活性：氮蓝四唑法

取5 mL 透明度好的指形管，依次加入1.5 mL的0.05 mol/L 磷酸缓冲液、0.3 mL 的130 mol/L Met、0.3 mL 的750 umol/L NBT 溶液、0.3 mL 的100 umol/L EDTA-Na2 溶液、0.25 mL 的蒸馏水，0.3 mL的20 umol/L 核黄素溶液和0.05 mL 的上清液（对照管中以缓冲液代替上清液），摇匀，将对照管置于暗处，测定管置于4 000 x 日光灯下显色20 min 后，立即用黑色塑料袋进行遮光处理，终止反应。以对照管作空白调零，分别测出各测定管在560 nm 处的吸光度，按下式计算SOD 活性：

式中：Ao对照管吸光度；As样品测定管吸光度；VT样品提取液的总体积（mL）；Vs测定时取酶液量（mL）；FW 样品鲜重（g）。

（3）过氧化氢酶（CAT）活性：紫外线吸收法

在比色杯中加入0.2 mL 上清液，将比色杯放入分光光度计的比色槽中，加入2.8 mL 的0.067 mo/L H2O2（比色杯中液体总体积为3 mL），立即按开始键，自动计时2 min，记录240 nm 处的OD 值，按下式计算CAT 活性：

（4）丙二醛（MDA）测定：硫代巴比妥酸法

取0.3 g 植物样片，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和2 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，研磨成匀浆；将匀浆转移到试管中，在用3 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，分2 次（每次1.5 mL）冲洗研钵，合并滤液；在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液；将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液出现小气泡开始计时）；到时间后，立即将试管取出放入冷水浴中；试管溶液冷却后，3 000 r/min 离心15 min 取上清液并量体积，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm、450 nm 处的吸光度，计算MDA 含量。

1.2.5 技术路线图

下图1 为研究土壤水分胁迫对不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶含量影响的技术线路图：

图1 技术线路图

2 实验处理与分析

研究抗氧化酶活性，采用盆栽观测法，选择圆形塑料桶，处理两年生的新疆大叶苜蓿。采用称重法控制土壤水分，设置3 个水分梯度（如下表1）。

表1 水分梯度

土壤水分处理标记为TA、TB、TC；土壤含水量占田间持水量的百分比分别为85%、65%、45%；每个梯度选择4 个桶进行试验，每桶各取3 个植株，测定其叶片中各个抗氧化酶的活性和丙二醛含量。

2.1 数据处理

使用Excel 2010 进行数据整理与绘图；使用SPSS 进行显著性分析。

2.2 数据分析

2.2.1 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿丙二醛含量的影响

从总趋势来看，两茬MDA 含量均随着生育期逐渐增长。就TB 而言，第一茬从0.03 增加到0.07，第二茬从0.016 增加到0.072，且各个生育期内的MDA 含量均是TC>TB>TC。第一茬中分枝期内TA与TC 差异显著，TB 与TC 同样差异显著（P<0.05）；在现蕾期内TA 与TC 差异显著，TB 与TC 差异显著；其他生育期内无显著性差异。第二茬中只有现蕾期内TA 与TC 差异显著，TA 与TB 差异显著，其余各个生育期内均无显著性差异。如图2 所示。

图2 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿丙二醛含量的影响

2.2.2 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿POD 活性的影响

图3 显示，两茬中POD 活性均在分枝期达到最大值，且各时期POD 活性均在TB 下达最大值，说明轻度水分胁迫有利于POD 酶活性的增强。在第一茬分枝期中，TA 与TB 差异性显著，TB 与TC 差异性显著（P<0.05）；开花期中TA 与TC 差异性显著，TA 与TB 差异性显著，TB 与TC 同样差异性显著，且随着生育期的发展呈先增高后降低的趋势。POD活性在分枝期3 种水分胁迫下均达到最大值，同时在各个时期，POD 酶活性均在TB 下达最高值。在第二茬分枝期中TA 与TC 均与TB 差异性显著，POD活性在现蕾期中3 种水分胁迫下两两差异性显著，开花期中TA 与TC 均与TB 差异性显著。同样，随着生育期发展呈先增长后降低的趋势。就TB 而言，第一茬POD 活性从返青期的3.157 8 增长到分枝期的6.543 6，再降低到开花期的3.111 7，且在各个时期中POD 酶活性均在TB 下达到最大值。

图3 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿POD 活性的影响

2.2.3 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿SOD 活性的影响

图4 表明，从总体上看，两茬中SOD 活性在分枝期达到最大值，且各时期SOD 酶活性均在TB 下达最大值，说明相比之下轻度水分胁迫有利于SOD酶活性的增强。在第一茬中，除了现蕾期内TA 与TC 没有显著性差异外（P<0.05），其余的各个时期均是两两有显著性差异。且随着生育期的发展呈先增高后降低的趋势，在分枝期3 种水分胁迫下均达到最大值，同时在各个时期，SOD 酶活性均在TB 下达最高值。在第二茬中返青期与分枝期内，均是两两有显著性差异。现蕾期内TA 与TB 和TC 都有显著性差异，开花期内TA 与TB 和TC 有显著性差异，同样随着生育期发展呈先增长后降低的趋势，在第一茬TB 中从返青期的161.598 5 增长到分枝期的266.383 1，再降低到开花期的136.787 8，且在各个时期中SOD 酶活性均在TB 下达到最大值。

图4 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿SOD 活性的影响

2.4 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿CAT活性的影响

图5 表明，随着生育期的发展，CAT 活性呈先增长后降低的趋势。图中第二茬TB 下从返青期的16.868 4 增长到分枝期的23.917 3，再降低到开花期的18.295 0。在各个时期内，CAT 酶活性均在TB下达到最大值。从两茬的总体情况来看，在轻度水分胁迫（TB）下有利于CAT 酶活性的增强。在第一茬返青期和分枝期内，TB 与TA 和TC 均有显著性差异，在现蕾期和开花期内TC 与TA 和TB 均有显著性差异（P<0.05），同时随着生育期的发展，CAT 呈逐渐增长趋势，且从整体上看，在各个时期内，CAT 活性都在TB 下达到最大值；在第二茬返青期和分枝期内，TB 与TA 和TB 均有显著性差异，在现蕾期内，TC 与TA 和TB 均有显著性差异。

图5 土壤水分胁迫对不同茬次新疆大叶苜蓿CAT 活性的影响

3 讨论与结论

3.1 讨论

在本次研究中，随着土壤水分胁迫的加剧，MDA 酶含量呈增长趋势（TC>TB>TA），而且随着新疆大叶苜蓿生育期的发展而发展，即随着植物器官衰老，MDA 酶含量逐渐增长。这表明越是在逆境条件下，或者在植物器官衰老时，膜脂过氧化作用就越强烈，相应地，其反应的产物丙二醛（MDA）就越多。此实验数据符合MDA 在逆境或衰老时含量越高的规律。MDA 是对膜系统有毒害作用的物质，其含量的多少能够反应出膜脂过氧化的程度，同时也能够反应出质膜被破坏的程度。MDA 与膜结构上的蛋白和酶结合，使蛋白结构和酶失去活性，从而对膜结构造成破坏，膜结构被破坏后，自然其水势会发生变化，所以植物进入了衰老过程，随着MDA 的积累，植物衰老的就越快。上述实验正好证明了这一点。而且CAT、SOD、POD 等保护性酶活性随着紫花苜蓿的衰老，其活性降低，也是因为随着器官衰老MDA 逐渐积累而造成的。

此外，随着水分胁迫的加剧，MDA 含量也呈增长趋势。这表明，随着水分胁迫的加剧，植物器官能吸收的水分就相应减少，渗透压进一步失调，加速了植物的衰老，因此MDA 的含量也就呈增长趋势。这与张建文等对萱草MDA 含量的研究结果相似。张建文等研究表明月季切花在衰老过程中MDA 是缓慢增多的，郁金香在整个衰老过程中MDA 也是逐渐增多的[11-15]。本实验也同样证明随着紫花苜蓿的衰老，其MDA 含量是逐渐增多的。

过氧化物酶（POD）是最重要的抗氧化酶之一，POD 催化过氧化氢氧化氨类和酚类脱氢，脱下来的氢把H2O2还原成水，从而保护了膜系统[16]。本实验表明，在两茬紫花苜蓿中POD 酶活性均是随着生育期的发展，呈先增长后缓慢降低的趋势，在分枝期达到最大值。且在各个生育期内，POD 酶活性均是在TB 下达到最大值。这说明，在紫花苜蓿前期，MDA含量较少，因而保护酶活性较高，而随着生育后期MDA 含量积累逐渐增多，对膜的危害越严重，加剧了植物器官的衰老，因此保护酶活性也相应的降低。POD 酶在TB 水分胁迫下达到最大值，表明在TB 水分胁迫下POD 酶能起到最佳的抗旱和抗氧化的作用。

超氧化歧化酶（SOD）在植物体内的含量很多，能够清除氧自由基，使其生成氧分子和水，起到相应的保护作用[17-18]，提高了植物的抗旱性。本次实验表明，两茬紫花苜蓿均是随着生育期的发展而增长，SOD 酶活性呈先增长后缓慢降低的趋势，在分枝期达到最大值。在各个生育期内，SOD 酶活性均是在TB 下达到最大值，其在紫花苜蓿生育后期活性降低的原因也跟MDA 酶含量增高有关系。同时，在两茬紫花苜蓿中SOD 酶活性均在TB 下达最大值，这同样说明，在轻度水分胁迫下有利于增强SOD 酶的活性，提高紫花苜蓿的抗旱性。相反，在充分供水条件下，SOD 酶的活性则相对较低，这说明在充分供水条件下不利于增强SOD 酶的活性。

过氧化氢酶（CAT）同样也是植物体内膜质过氧化过程中主要的保护酶之一，它是最重要的抗氧化酶，CAT 可以催化两个过氧化氢分子生成氧气和水，从而保护膜系统[19-20]。在第一茬中，CAT 酶活性在前期增长明显，而在后期则趋于缓慢增长趋势，说明在生育前期MDA 含量少，因此CAT 保护酶活性强，而后期因为MDA 含量积累过多，抑制了CAT 酶的活性。在第一茬的各个时期内，CAT 酶活性均在TB 状态下达到最大值，这表明在中度水分胁迫下有利于CAT 酶活性的增强。在第二茬中，随着生育期的发展，在紫花苜蓿生育后期CAT 酶活性有所降低，这与MDA 含量积累过高有关。随着植物器官的衰老，各项生理机能的减弱，有关保护酶活性自然会降低。在第二茬的各个时期，CAT 酶活性在TB 下达到最大值，这说明在轻度水分胁迫下有利于CAT 酶的活性，而在充分供水条件下CAT 酶含量有所降低，可能是因为过多的水分破坏了CAT 的分子结构，导致其活性降低。

总之，本次研究表明，随着紫花苜蓿生育期的发展，MDA 酶含量逐渐增高。而3 种保护酶活性则呈现先增高后降低的变化。同时，在不同水分胁迫下，MDA 含量在TC 下达最大值，而3 种保护酶活性则在TB 下达到最大值。说明MDA 酶和3 种保护酶之间相互影响，彼此制约；同样表明紫花苜蓿有较强的抗旱性，在干旱地区种植该种植物，有利于促进当地的畜牧业发展。

3.2 结论

本实验对土壤水分胁迫对不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响进行研究。研究表明，随着紫花苜蓿的生育期发展，丙二醛含量呈逐渐增长趋势（TC>TB>TA），且随着土壤水分胁迫的加剧，丙二醛含量也呈逐渐增长的趋势。这说明在逆境或衰老情况下，紫花苜蓿的丙二醛含量会增高。

同样，随着紫花苜蓿生育期的发展，3 种保护性抗氧化酶的活性呈现先增高后降低的趋势，在分枝期达到最大值，且在各个时期，3 种保护性抗氧化酶的活性均在轻度水分胁迫（TB）下达到最大值，说明轻度水分胁迫下有利于增强紫花苜蓿保护性酶的活性。这一结论也说明，紫花苜蓿具有较强的抗氧化性和抗旱性，适合在干旱和半干旱地区种植，能够发挥出其巨大的生态价值和经济价值。