葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种及发酵工艺优化

赵芬芬，黄月荣，赵 辉，吴 静，姜冬冬

1.郑州黄河护理职业学院，河南 郑州 450000；2.郑州源创基因科技有限公司，河南 郑州 450000

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一种重要的工业酶制剂，其在有氧条件下能够专一地将β-D-葡萄糖氧化，同时产生过氧化氢和葡萄糖酸[1]。GOD 当前被广泛应用于食品、医药、饲料等领域。目前可用于工业化生产GOD 的菌株共有30 多种，但大部分菌种都存在活化程度低、发酵时间长、产酶率低等问题。因此，选育高活性的GOD 生产菌株，开发一种用于GOD 菌种活化生产的培养基，对于缩短发酵周期、提高产酶量、降低生产成本具有重要现实意义。本文以桔青霉为生产菌株，对其进行诱变处理，并设计了一种快速筛选高产菌株的方法，以农业废弃物为基质发酵生产酶，对发酵条件和培养基组分进行优化，经过优化的GOD 产量得到了明显提高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桔青霉（Penicillium citrinum）CICC40277 购买自中国工业微生物菌种保藏中心。

培养基：

（1）孢子培养液（g/L）：Sucrose 30.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.012，K2HPO41.0，pH 为6.0～6.5。

（2）种子固体培养基：选定固液比为1∶1（W/V），取固体基质（葡萄皮、香蕉皮、橘子皮、甘蔗渣、木薯叶、甜茶叶、麦麸）各5 g 置于250 mL 三角瓶中，分别加入5 mL 无机盐溶液（Yeast powder 2.0、MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0，单位：g/L），pH为6.0～6.5，搅拌混匀。

（3）液体发酵培养基（g/L）：Sucrose 30.0，Yeast powder 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO42.0，KCl 0.3，CaCO33.0，pH 为6.0～6.5，搅拌混匀。

（4）诱变筛选培养基：即添加有2-脱氧-D-葡萄糖（1 g/L）的马铃薯琼脂培养基，加入0.001%（W/V）的甲基红作为指示剂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化

将购买的菌株取出，加入40 mL 孢子培养液，洗脱至250 mL 三角瓶中。置于摇床上振荡培养2 h，培养温度为30 ℃，摇床转速为180 r/min。

1.2.2 种子固体发酵

将发酵培养基置于121 ℃条件下灭菌20 min，冷却后接种孢子悬浮液，接种量为20%（V/V）。放置在恒温培养箱中进行培养，温度设置为30 ℃。发酵结束后，向菌种固体发酵培养基中加入40mL pH 为7.0 的磷酸缓冲液。于30 ℃、200 r/min 的摇床上震荡浸提1 h，所得浸提液即为种子培养液。

1.2.3 液体发酵培养

将经过固体培养基活化后的种子培养液接种到液体发酵培养基中，接种量为20%（V/V），于30 ℃、200 r/min 的摇床上震荡发酵培养12 h，离心后出取上清液，即得粗酶液。

1.2.4 高产GOD 菌株的诱变筛选

将经过紫外诱变（紫外灯功率为30 W，照射距离为10 cm，照射时间分别为0、1、2、3、4、5、6 min）和微波辐射诱变（微波炉功率800 W，频率2 450 MHz，处理时间分别为0、20、30、40、50、60 s）处理后的孢子悬浮液涂布在诱变筛选培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中避光培养5 d 后，挑选形态较大、周围变色圈较大的菌落进行液体发酵培养，测定其产酶能力。

1.2.5 种子固体培养基发酵条件的优化

对固液比、发酵时间、温度、pH、接种量等方面进行单因素优化。

1.2.6 种子固体培养基发酵组分的优化

在已确定最适发酵条件的基础上，研究不同的碳源、氮源对菌株产酶活力的影响。选用乳糖、蜂蜜、淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖分别作为碳源，添加量为5%（W/V），研究不同碳源对酶活力的影响。在确定最佳碳源后，再进一步研究其浓度从1%～11%（W/V）对菌株产酶效率的影响。在此基础上，选用NHCl、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NaNO3、Yeast powder 和蛋白胨分别作为氮源，添加量为0.5%（W/V），在确定最适氮源后，对其位于0.2%～1.2%（W/V）之间的最适浓度继续进行研究。

1.2.7 GOD 酶活力的测定

参照周建芹等[2]所建立的靛蓝胭脂红褪色分光光度法来测定GOD 的活力，公式如下：

式中：C 为根据标准曲线计算得到的H2O2浓度变化值；V为反应液体积（mL）；Df 为酶液稀释倍数；T为反应时间（min）；Ve 为酶液体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 不同种子培养方式对桔青霉产GOD 的影响

本实验考察了固、液发酵两种体系对菌种产酶的影响，实验结果显示，液体发酵和固体发酵两种发酵体系均可用于种子的活化培养。在液体培养体系中，需要经过120 h 的种子发酵培养，GOD 的酶活最高仅能达到24.96 U/g；而在固体发酵体系中，以木薯叶为固体基质的种子培养基，仅需经过96 h 的活化培养，GOD 的酶活就可达到最高值66.48 U/g。

2.2 诱变结果

经紫外、微波诱变后筛选得到96 株耐受2-脱氧-D 葡萄糖的菌株，根据菌落周围红色圈的大小挑出44 株菌予以发酵培养，其中有9 株菌的酶活要高于原始菌株（66.48 U/g），而在这其中又属Uv-7 号菌株的酶活最高，达到了79.76 U/g，与原始菌株相比酶活提高了20%。

2.3 P.citrinum Uv-7 产GOD 菌种固体发酵条件的优化结果

本实验考察了不同固液比、发酵时间、温度、pH、接种量对菌种固体发酵产酶的影响，由图1-（a）可知，当固液比为1∶1（W/V）时，菌株产GOD 的酶活最高，达到73.84 U/g；当接种量为20%（V/V）时，菌体生长旺盛，GOD 的产量达到最大值77.76 U/g；经过144 h 的恒温固体培养活化后，GOD 的酶活力达到最大值78.96 U/g；当盐溶液的pH 为6.0 时，GOD 的产量达到最大值79.2 U/g；不同温度下菌种的生长状态呈现出显著差异，当培养温度为30 ℃时，酶活达到最大值79.76 U/g。

图1 菌种培养基发酵条件对葡萄糖氧化酶产量的影响

2.4 P.citrinum Uv-7 产葡萄糖氧化酶发酵培养基组分的优化结果

本实验还研究了不同的碳源、氮源对菌株活化产GOD 的影响，实验结果如图1-（b）所示。由图可知，选用葡萄糖作为碳源时，GOD 的产量最高，达到91.76 U/g；当葡萄糖的添加量为3%（W/V）时，酶活力达到最大值101.52 U/g。研究结果表明，只需额外添加少量的葡萄糖即可显著提高葡萄糖氧化酶的产量，这可能是因为木薯叶中所含有的糖类物质已经基本满足了菌体对碳源的需求。

2.5 木薯叶菌种培养基成本核算

经单因素优化后得到木薯叶菌种培养基最优辅料组分为：5.5 g 木薯叶，按照1∶1（W/V）的固液比添加盐溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0、葡萄糖30、酵母粉6，pH 为6.0。根据2022 年相关材料数据进行核算，得出木薯叶菌种培养基成本仅需65.889 元/t。

3 结论

本研究通过比较固、液培养对菌种生长与产酶量的影响，确定了最优菌种活化体系是以木薯叶为基质，经96 h 培养后，GOD 的活性达到66.48 U/g，与液体活化（24.96 U/g）相比提高了2.66 倍。然后采用单因素试验对P.citrinum Uv-7 菌株产GOD 的最佳菌种培养条件进行优化，发现菌株产GOD 的活性从66.48 U/g 提高到了101.52 U/g，提高率为52.7%。廖兆民等[3]采用基因克隆的方式，将黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中进行共表达后对产酶条件进行优化，其GOD 酶活相比初始重组酵母提高了50.2%。而本研究经菌种固体发酵培养后，经菌种固体发酵培养后，仅需24 h 的液体发酵即可获得较高的酶活，大大缩短了整体发酵培养时间，有利于节约工业化生产成本和时间。

对木薯叶菌种固体培养基进行成本核算，得到其成本仅需65.889 元/t。张庆芳等[4]通过研究得到液体种子培养基组分为葡萄糖6%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.02%、MgSO4·7H2O 0.07%、KCl 0.05%、NaNO30.4%，pH 为7.0 时，按照同样的标准核算后，其成本为134.032 元/t，而本研究的成本与之相比减少了68.143 元/t。

采用2-脱氧-D-葡萄糖为菌株抑制剂和甲基红为指示剂建立了一种高效、简便的筛选方法。2-脱氧-D-葡萄糖可以抑制细菌的生长，但对产GOD菌株的生长无抑制作用[5]。GOD 能够使葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸，从而使培养基的酸性增强。本研究以甲基红为指示剂，通过显色圈的大小可以快速的筛选出高产GOD 的菌株，该试剂安全、低毒、经济，高效。

本研究结果为葡萄糖氧化酶的安全工业化发酵生产提供了理论依据和数据支持。证明了固体发酵不仅能使生产成本有所降低，而且能使菌株产酶性能也明显提高。

中国是农业大国，利用农业废弃物为基质发酵生产酶等副产品，可实现农业经济效益和生态效益的同步提升。